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骨髓间充质干细胞来源的肌肉微细胞球炎症模型的构建

吴德应  
【摘要】:在长期药物筛选的实践中,常用的动物筛选模型虽然可以直观的反应药物疗效与不良反应。但由于动物样本的特殊性,导致动物模型在药物筛选过程中暴露出效率低、成本高等缺点。传统的细胞筛选模型虽然有效的解决了动物筛选模型效率低下等问题,但由于二维平面培养的细胞无法模拟体内真实环境,导致药物作用结果往往与体内实验相差较大,不能反应实际药效。成体干细胞(Adult stem cells,ASCs)来源广泛,是目前组织工程与细胞治疗理想的种子细胞。三维细胞培养技术可以真实模拟体内微环境,有效解决二维平面培养的细胞与体内真实环境差异大的问题。因此,本论文以骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)为模型,通过定向分化技术获得目标细胞,并通过3D培养制备细胞微球,并以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)为致炎诱导剂,构建细胞微球炎症模型。以期该模型在药物筛选中获得潜在的应用前景。首先,制备定向分化表达载体质粒,同时研究BMSCs生物学特性。通过基因工程技术,以自剪切2A肽为连接元件构建成肌分化表达载体质粒与内皮分化表达载体质粒,质粒双酶切结果与测序信息结果显示质粒载体构建成功。通过对BMSCs的培养,观察到BMSCs在培养的第4 d进入对数生长期,7 d后达到平台期。吉姆萨染色结果显示处于对数生长期的BMSCs细胞胞浆充盈,细胞活性较强。通过对BMSCs进行长时间传代培养,发现细胞老化的同时,受培养环境影响而发生向成肌细胞,成骨细胞,神经细胞的分化。其次,制备BMSCs来源的成肌细胞与内皮细胞并研究其生物学特征。通过脂质体介导定向分化表达质粒转染细胞,将BMSCs定向分化为绿色荧光蛋白标记的成肌细胞与红色荧光蛋白标记的内皮细胞。利用遗传霉素G418抗性筛选转染后的细胞,挑取单克隆细胞团,并进行细胞放大培养,获得目标种子细胞系。细胞形态学观察结果显示BMSCs来源的成肌细胞呈现长梭形的成肌样,在荧光显微镜下发射绿色荧光;BMSCs来源的内皮细胞呈铺路石状的多边形形状,并发射红色荧光。RT-PCR与细胞免疫荧光染色实验结果进一步验证了分化后的细胞表达与目标细胞一致的特异性基因与特异性蛋白。随后,制备与表征BMSCs来源的肌肉微细胞团。以琼脂糖凝胶为基底,对24孔板进行铺胶,制备U形的3D培养系统。将BMSCs来源的成肌细胞与内皮细胞按不同比例进行3D共培养。实验结果显示成肌细胞:内皮细胞(4:1)是形成内皮-成肌微细胞球的最佳比例。细胞团形态学观察与SEM观察实验结果显示,通过以最佳比例共培养7 d可以得到300μm左右且具有一定机械强度的微细胞团。对构建的球状细胞微球进行特异性基因表达分析,利用Real-time PCR定量分析球状微载体培养7 d后成肌与内皮相关基因的表达情况。结果显示,相比于2D培养环境,三维培养条件下,成肌相关基因Myogenin、Desmin和内皮分化基因CD31、vWF的表达量都显著降低。说明3D细胞培养有助于延缓细胞分化程度,所形成的细胞球更类似于肌肉干细胞与内皮祖细胞的集合。最后,构建BMSCs来源的肌肉微团炎症模型,考察其在药物筛选中的应用潜力。利用LPS为诱导剂,制备内皮-成肌微细胞球炎症模型。采用ELISA实验测定细胞培养液中TNF-α与IL-1β含量,实验结果显示,相比于对照组,以1μg/mL LPS作用微组织12 h可获得微细胞球的最佳致炎效果。以藤黄酸(Gambogic acid,GBA)为模型药物作用于炎症模型,实验结果表明BMSCs来源的肌肉细胞微球炎症模型能有效被药物作用。综上所述,利用基因工程手段定向分化而来的内皮细胞与成肌细胞具备目标细胞的特征,通过3D细胞培养技术获得300μm左右的微细胞球具备一定机械强度。通过LPS刺激形成稳定的微球炎症模型,可为微组织炎症模型及其它疾病模型的构建提供参考。


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