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不产氧光合细菌氮代谢新途径的挖掘与环境调控机制

朱笔通  
【摘要】:氮污染已扰乱生态系统并影响到人类健康和经济发展。自然界的氮循环过程主要由代谢多样性微生物构成的复杂代谢网络所驱动,因而微生物在生态系统的氮平衡以及氮污染治理等方面起着重要作用。近年来,新的氮代谢途径不断被发现,为氮污染环境的治理提供了新的视角和有效途径。不产氧光合细菌(Anaerobic Phototrophic Bacteria,APB)广泛分布于各种生境,对自然界碳氮硫等元素循环不可或缺。然而,它们适应环境变化的细胞代谢机制仍缺乏系统全面的认识。海洋着色菌(Marichroamtium gracilie)YL28分离自红树林特殊生境,不但能以高浓度亚硝氮为唯一氮源生长,也能高效去除水体无机三态氮,是目前对亚硝氮耐受和去除能力最高的APB菌株之一,但其脱氮机制,尤其是对亚硝氮利用和耐受机制尚不清楚。本文从比较基因组水平上解析了APB碳氮硫代谢通路,系统阐明了36株紫细菌的氮代谢途径以及YL28高效脱氮和耐受亚硝氮的分子机制,挖掘验证了APB氮代谢的1条新途径和1个新基因,提出了1条新型的微生物氮代谢途径。进一步以YL28为材料,阐明了YL28对于外界氮源扰动、光氧变化响应规律以及3条共存氮代谢途径之间相互协调关系。最后探究YL28对海水养殖水体氮污染的原位去除效果。主要研究结果如下:1.对数据库公布的36个APB菌株基因组分析表明,APB拥有7条氮代谢途径,首次在微生物中发现了非氨单加氧酶依赖的氨氧化途径。首次发现APB也具有异化硝酸盐还原至氨途径(DNRA)。首次发现紫硫细菌类群也拥有同化硝酸盐还原途径(ANR)。另外,APB中的固氮基因多源自基因水平转移,反硝化途径(DN)多为不完全反硝化。YL28菌株的硫代谢通路主要有硫氧化、异化硫还原和Sox系统,碳代谢主要有EMP、HMP、TCA、乙醛酸循环、还原性柠檬酸循环等,还含有重金属抗性蛋白、甜菜碱和duf2062等渗透压调节因子。2.蛋白序列比对和同源建模显示,ANR的NirA和DNRA的NrfA(Otr家族)与已知功能蛋白一致性仅有27.1%和19.2%,异源表达验证了这2个新基因的酶学功能,理化性质显示NirA和NrfA最适作用温度和pH分别为40℃、35℃和6.0、5.0。非氨单加氧酶依赖的氨氧化途径验证结果显示,Vc(羟自由基抑制剂)可抑制约80%的羟胺生成,过氧化氢(羟自由基促进剂)可提高50%羟胺生成量,表明羟胺的生成是羟自由基所致。酶活验证还表明有羟胺还原途径的存在,羟胺还原酶(Hcp)与已知功能蛋白序列的一致性为55.3%,最适作用温度和p H分别为35℃和6.0。3.共存氮代谢途径对环境氮扰动、光氧变化的响应和协调规律以及碳氮硫循环耦联关系。3条氮代谢途径关键酶基因转录水平结果显示:(1)ANR途径受氨氮明显抑制,2 mg/L氨氮可抑制50%的nirA表达量;DN途径受氨氮影响较小,硝氮、羟胺和亚硝氮对其有促进作用;4种无机氮均对DNRA途径有促进作用;羟胺还原途径受氨氮抑制,氨氮存在时,硝氮、羟胺和亚硝氮对其影响较小。(2)随硝氮浓度增加,ANR、DN和DNRA活性均提高,与低浓度硝氮相比,高浓度硝氮时的DN活性提高37倍(norB)和18倍(nar I),ANR活性提高约36倍(nirA),DNSR活性提高约2.5倍(nrf A)。(3)有光无光时,DN和ANR均发挥作用,DN表达量比无光时提高约28倍(norB)和20倍(narI),ANR(nirA)表达量提高约24倍。无光时,ANRDNDNRA。(4)有氧无氧时,DN、ANR和DNRA均有活性,但厌氧环境更有利于其发挥作用;厌氧时,DN表达量比有氧时提高约37倍(norB)和16倍(narI),ANR提高约20倍(nirA),DNRA提高约3倍(nrf A);好氧时,ANR表达能力高于DN和DNRA。(5)在厌氧有光/无光、在氨氮和硝氮/亚硝氮共存环境下,DN表达能力高于DNRA,ANR受显著抑制。通过基因富集分析,获得了碳氮硫耦联关键因子为glt B、glnA和cysE,实验结果表明YL28脱氮除硫最佳碳氮硫比例为C:N:S=7.56:6:5。4.YL28安全无毒。在有氧/低氧且不添加外部碳源条件下,YL28能同时有效去除氨和亚硝氮,并防止N过度流失。室内对虾养殖水体脱氮研究显示,YL28能够同时去除水体中高浓度氨氮(3.5 mg/L)和亚硝氮(1 mg/L),在7 d内,约99.96%的亚硝氮和95.6%的氨氮被去除。在零交换水的大田对虾养殖水体中(20 d),YL28显著抑制氨氮积累,亚硝氮脱除率达99.3%(1.25 mg/L)。综上所述,本文发现微生物具有一条新的非氨单加氧酶依赖的氨氧化途径,发现和验证了ANR和DNRA途径的2个新酶。YL28耐受高浓度亚硝氮和高效除氮的分子机制是细胞内3条氮代谢途径(DN、ANR和DNRA)相互协调所致,可在有光无光、有氧和厌氧条件下均具有除氮特性,这为氮污染的有效治理以及APB的合理施用提供了重要科学依据。


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