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炮制对当归蛋白影响的研究

张小梅  
【摘要】:本课题以中药当归炮制的三个阶段:鲜品当归、生药当归和饮片当归的蛋白质为对象,探究当归蛋白的功效,并通过对比三个阶段当归总蛋白的生物活性及理化性质的变化,探讨炮制对当归蛋白的影响。本课题首先采用80%的硫酸铵将当归粗提液中的蛋白全部沉淀,其次通过透析脱盐并去除其他小分子。制备得到糖去除率达到99.9%以上的当归总蛋白,蛋白得率:鲜品6.80%、生药33.56%、饮片25.12%。研究结果表明,鲜品当归中含有多种蛋白质,包括中高分子量(25-120 kDa)和低分子量(15-18 kDa),其中低分子量蛋白含量最高。鲜品当归蛋白具有丰富的生物活性,可以清除DPPH自由基、抗凝血、选择性促进人正常肝细胞增殖,在水溶液中还可自组装成纳米颗粒,此外其清除DPPH自由基能力、抗凝血活性和自组装而成的纳米颗粒粒径随热处理程度的增加而增加。鲜品炮制成生药和饮片后,中高分子量的当归蛋白含量有所下降。三个阶段的生物活性变化如下:清除自由基能力:鲜品阶段生药阶段=饮片阶段;抗凝血活性:饮片阶段生药阶段鲜品阶段;促正常肝细胞增殖作用:饮片阶段鲜品阶段生药阶段,抑制白血病细胞增殖作用:饮片阶段生药阶段鲜品阶段;自组装而成的纳米颗粒粒径:鲜品阶段生药阶段=饮片阶段。在上述活性中,抗凝血作用和选择性细胞效应变化最大。随着炮制程度的加强,当归蛋白从减缓凝血(鲜品)变成使血液完全不凝(饮片)。对L-02细胞的增殖作用,细胞存活率从110.81%(鲜品)增至544.23%(饮片),对K562细胞的抑制作用,抑制率则从14.41%(鲜品)增至21.42%(饮片)。当归蛋白理化性质的分析结果表明,在炮制的不同阶段,当归蛋白的碱性氨基酸含量不断下降(三个阶段分别为12.792 g·kg-1、11.739 g·kg-1、11.019 g.kg-1),而当归蛋白的糖基化程度不断增加,说明炮制过程中当归蛋白产生了美拉德反应。糖基化程度的增加不仅提高蛋白稳定性,同时增强其重要的生物活性。最后,采用硫酸铵分级沉淀和超滤初步得到鲜品低分子量蛋白AS-X-I。该蛋白分子量为16.1 kDa,无二硫键,在溶液状态下主要以单体的形式存在。上述结果表明,当归中的蛋白质具有非常重要的生物活性,是新型的当归有效成分,炮制可增强当归蛋白的糖基化程度,增强其稳定性、抗凝血效应和选择性细胞效应。


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