黑曲霉中纤维素酶的分离纯化与表征及其动力学作用机制

【摘要】： 本文是关于黑曲霉(Aspergillus niger)中两种纤维素酶的分离纯化与表征及其动力学作用机制的研究。使用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25脱盐、DEAE-TOYOPEARL 650M和POROS 20PI弱阴离子交换色谱等分离技术，从福建沙县酶制剂厂生产的黑曲霉发酵酶粉中分离纯化出一个内切β-葡聚糖苷酶(EC 3.2.1.4)，经SDS-PAGE电泳和毛细管液相色谱(cLC)鉴定，为单一组分；再通过两步DEAE-TOYOPEARL 650M弱阴离子交换色谱，从SephadexG-25脱盐组分中纯化出一个β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)经SDS-PAGE电泳鉴定，也是单一组分。 内切β-葡聚糖苷酶对羧甲基纤维素钠的比活力为433.38 IU／mg，并对其专一，不能水解棉花和水杨素；分子量为36.0KDa，加DTT后为38.0KDa；该组分最适pH和温度分别为3.5和55℃，在pH5.0、50℃下对羧甲基纤维素钠的米氏常数Km为7.41mg／mL，最大反应速度Vm为0.094mg／(mL·min)，水杨素对该组分具有抑制作用；N-末端氨基酸序列为N-XXXFKCVGTSECGAEXGXALPG-22，经序列分析发现，该组分是一个新的内切β-葡聚糖苷酶。 β-葡萄糖苷酶对水杨素的比活力为597.12IU／mg，并对其专一，不能水解棉花和羧甲基纤维素钠；分子量为117.5KDa，加DTT后分子量不变；该组分最适pH和温度分别为4.5和70℃，在pH5.0、50℃下对水杨素钠的米氏常数Km为3.73mg／mL，最大反应速度Vm为0.088mg葡萄糖／(mL·min)；与文献中从黑曲霉中分离的β-葡萄糖苷酶比较后发现，该组分是一个新的β-葡萄糖苷酶。 β-葡萄糖苷酶与内切β-作用，可加速水解羧甲基纤维素钠；内切p·葡聚糖苷酶对β葡萄糖苷酶水解水杨素具有抑制作用。经两组分共同作用的酶反应动力学分析后发现，两组分这种相互作用机制的核心是：内切酶和β—葡萄糖苷酶与内切酶的水解产物，也是其底物类似物——纤维二糖和纤维寡糖的结合以及β-葡萄糖苷酶对该产物的水解。