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利用高效离子交换色谱分离分析动物肠道菌群方法初探

陈章捷  
【摘要】:高效离子交换色谱已被证明能根据细菌细胞的荷电性及表面构造快速而高分辨率地分离不同种属的细菌。该法用于分析动物肠道菌群这样的复杂细菌生态体系,有可能克服现有研究方法所存在的效率低而结果不直接的不足,将把与宿主营养和健康关系密切的肠道菌群研究推向新的高度。本课题首次尝试建立小白鼠肠道菌群的高效离子交换色谱分析分离法,并应用该法考察服用益生菌对小白鼠肠道菌群的影响,奠定了高效离子交换色谱分析肠道菌群方法的基础。 首先,选用昆明种小白鼠作为首个实验动物对象,考察了各种粪便预处理方法对肠道菌群提取效果,比较杂质去除效果和细菌回收率两个因素,确定过滤法为粪便中提取肠道菌群的最佳方法。 其次,采用TSKgel SuperQ-TOYOPEARL 650C 强阴离子交换树脂分离菌群,外联激光光散射仪配合高效液相色谱的紫外检测器联合检测流出液。确立了小鼠肠道菌群最佳分离条件:采用0.02mol/L 哌嗪盐酸(pH8.0)缓冲体系,每次处理量为0.1g 小鼠粪便粗品,洗脱盐浓度为1mol/LNaCl。流速为1mL/min,梯度0~50%/60min ,然后50%~75%/20min,最后100%高盐/15min。 光散射谱图上得到20 个洗脱组分,配合紫外检测谱图可以初步判断洗脱峰的组成,进一步对各洗脱峰涂片镜检,发现其中17 个光散射谱图上的峰是细菌峰,各细菌峰的镜下形态差别初步说明了本方法对不同表面性质的肠道菌群的分离是有效可行的。 对各细菌峰面积和细菌峰组分平板菌落计数结果进行分析,发现两者呈现较好的线性关系,证明光散射谱图可以用于肠道菌群的定量分析,将来可用于确定不同种属的肠道菌在整个肠道菌群体系中的丰度。 在成功建立肠道菌群的色谱分离法的基础上,应用该法分析服用双歧杆菌对小鼠肠道菌群的影响,对小鼠粪便细菌的色谱分析结果表明小鼠双歧杆菌活菌制剂后,其粪便中双歧杆菌含量显著增加,除第8,15,16 峰减少之外,其余细菌峰面积增加,这和双歧杆菌的益生效果相符,这是迄今双歧杆菌对肠道菌群作用的第一个直接证据,表明该方法可以直观准确地指示由于动物体生理状态的改变而引起的肠道菌群数量和组成的变化。 用相同方法对家兔肠道菌群进行分离,其谱图同小鼠肠道菌群分离谱图有较大的不同,说明本方法针对不同种属动物具有较大的结果差异性,可以用于不同动物肠道菌群体系之间的比较研究。 总之,本课题所确立的高效液相离子交换色谱从动物粪便中分离分析肠道菌群的方法有效可行,可以用于肠道菌群及其分离组分的定量分析,同一个体在不同生理条件下的肠道菌群状态研究和不同个体肠道生态的比较研究,可望为阐明动物肠道菌群与其宿主的健康营养的关系发挥重要作用。


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