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绿豆生物活性物质的研究

汪少芸  
【摘要】:本论文是关于绿豆中生物活性物质的分离纯化、表征、蛋白质晶体培养、X-衍射及其结构与功能关系的研究。利用硫酸铵沉降、弱阳离子色谱CM-Sephadex C-50、POROS 20HS高效液相强阳离子交换色谱和Sephadex-G75凝胶色谱等方法从绿豆中分离纯化出包括苹果酸脱氢酶、几丁质酶、溶菌酶和非特异性脂转移蛋白等四个生物活性物质。并经SDS-PAGE、ClC反向色谱、质谱及N-端氨基酸测序鉴定了各活性物质的纯度。 苹果酸脱氢酶由SDS-PAGE 鉴定为单倍体蛋白,分子量为38.0 kDa,等电点为9.7。最适pH 为7.2,最适温度为35℃,Km为112μM。N-末端序列为N-ASEPGPERKVAVLGAAGGIG-20,与其它植物来源的MDHs 的同源性75%~95%不等。K~+ 对酶有激活作用,Ca~(2+) 和Mg~(2+)对酶活影响不大,Zn~(2+), Pb~(2+) 和Cu~(2+)抑制酶活作用,Zn~(2+)的抑制类型为非竞争性抑制。 几丁质酶由SDS-PAGE 鉴定是单倍体蛋白,分子量为30.8 kDa,等电点为6.3。最适pH 值为5.4,最适反应温度为40~50℃。对菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、花生褐斑病菌和水稻白绢病菌表现出抑菌活性。 溶菌酶是分子内存在二硫键的单倍体蛋白,分子量为14.4kDa。N-末端序列为N-DMPGKVALTAQSF-13,与鸡蛋清溶菌酶(HEWL)同源性为23%。最适pH 值为5.5,最适反应温度为55℃。对菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、水稻白绢病菌、立枯丝核菌和葡萄灰霉病菌六种真菌和金黄色葡萄球菌具有很明显的抑菌活性。对菜豆根腐病菌的IC50 值为11μM,对金黄色葡萄球菌的MIC 值为0.26μM。 非特异性脂转移蛋白nsLTP 是分子内存在二硫键的单倍体蛋白,分子量为9292Da;具有脂结合活性;对真菌菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、水稻白绢病菌和金黄色葡萄球菌表现出抑制作用,对金黄色葡萄球菌的MIC 值为0.06 mmol/ml;N-端序列为N-MTCGQVQGNLAQCIGFLEKGG-21,与其他植物来源的同种蛋白具有较高的相似性。 根据Crystal Screen 配制结晶缓冲液筛选结晶条件,确定以硫酸铵为沉淀剂,辛基-β-D-喃葡萄糖为去污剂,0.1mol/L Tris-HCl,pH8.5 的条件下晶体生长。在297K,约7天时间长出尺寸0.3×0.15×0.15mm的单晶。该晶体属于斜方晶形,晶胞参数为a =38.671, b = 51.785, c = 55.925A|°,α=β=γ=90℃,空间群为P2_12_12_1, 分辩率达2.4A|°。假定一个不对称单位含一个分子,Z = 4,则V_M 值约3.0A|°~3 Da~(-1),水溶液含量约58%。 非特异性脂转移蛋白nsLTP 的结构存在着由4 个α-螺旋通过柔性环连接所形成的一个相对紧密的可以结合油脂的内陷的疏水空腔,该结构由8 个高度保守的半胱氨酸残基所组成4 个二硫键所稳定。NsLTP 抑菌机制的重要分子基础是具有脂结合活性、分子结构中存在一个由4 个α螺旋组成的疏水空腔结构和α螺旋具有两亲性。


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