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花生文库构建和逆境胁迫基因的分离与表达鉴定

姜宝杰  
【摘要】:花生是世界上重要的经济作物和油料作物之一,也是许多发展中国家植物油和蛋白质的重要来源。花生生产的发展对于增加农民收入和保障国家油料安全具有重要意义。果针是实现花生地上开花、地下结荚的器官,果针的研究历来受到植物学家的重视。花生在其生长发育以及储存过程当中极易受到各种病原菌尤其是黄曲霉的浸染,严重影响花生生产、加工和贸易。果皮是花生荚果的屏障,对保护种仁、抵御病虫侵染和环境胁迫至关重要。种皮渗透性低,韧性强,耐破损等特征及其完整性可抵御黄曲霉菌的入侵和定殖。因此花生果皮及种皮的研究具有重要的科学和实用价值。此外,花生生长发育易受到其他各种环境因素诸如低温、干旱、营养匮乏等的影响,而造成花生减产以及品质下降。克隆花生抗逆基因将为理解花生抗逆分子机理提供理论依据,对改良花生品种奠定基础。 cDNA文库的构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。SMART法由Clontech公司创建,主要利用PowerScriptTMRT反转录酶和内切酶SfiⅠ的特性,快速、简单地构建全长cDNA文库。本论文以本实验室花生闽花6号为材料,运用SMART法构建了花生果针、果皮、种皮及各种胁迫处理混合全长cDNA文库。经鉴定,果针原始文库的滴度为1.3×10~6cfu、果皮文库为1.3×10~7cfu、种皮文库为1.23×10~6cfu、逆境胁迫文库为8.86×10~6cfu。果针文库重组率大10~0%、果皮文库为95.5%、种皮文库为93.3%、逆境胁迫文库为97.6%。大部分插入片段在1.0-2.0kb之间,插入片段平均大小大于1.0kb。 本论文在以闽花6号454测序及基因芯片筛选的基础上,从中筛选了14个受逆境胁迫影响的基因,运用半定量RT-PCR技术分析了各种胁迫处理下的各基因表达变化,详细分析了在ABA、水杨酸、乙烯利或多效唑处理后不同基因在不同时期的表达模式,结果表明,有两个基因的表达受到ABA的诱导、六个基因受水杨酸诱导、两个受乙烯利诱导、三个受多效唑诱导。此外还对14个基因进行了功能注释,初步预测各基因的分子功能及代谢途径。 通过本论文的研究,成功构建了花生各组织及逆境胁迫全长文库,为筛选和克隆花生重要基因提供了平台。14个重要基因的分离和表达模式鉴定,可为花生抗性基因的研究提供参考。接下来将以本论文中所购建的全长cDNA文库为平台克隆其中重要基因的全长序列,对其重要功能及表达进行深入的研究。


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