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短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis)对龙眼保鲜机理的研究

车建美  
【摘要】:本研究通过分析龙眼果实采后腐烂过程相关酶系的变化规律,探讨龙眼褐变和腐烂的机理,并筛选了龙眼保鲜微生物,研究了该保鲜微生物的生物学特性和保鲜机理,制备了龙眼微生物保鲜菌剂。主要研究结果如下: 1龙眼保鲜微生物的筛选及相关生物学特性分析 从本实验室已有菌种库中筛选到6株对龙眼腐生真菌和细菌均具有较好拮抗作用的菌株,其中短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX(Brevibacillus breivs FJAT-0809-GLX)对龙眼腐生细菌和真菌的抑菌效果最好,抑菌圈直径为15.87 mm,抑菌带为6.27 mm。对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX培养条件的研究表明,该菌株培养的最适条件为:转速180 rpm、pH值7.0的培养基、250 mL三角瓶装瓶量20-40 mL、培养48 h。对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX的全基因组测序初步分析表明,该菌株的基因组规模为6 Mb,预测得到5666个基因,平均长度为933 bp,基因密度达到87.83%,基因组的GC含量为47.30%,具有177个菌株特异基因,这些基因的功能如何还有待于进一步的分析。 2龙眼果实致腐机理的分析 从细胞形态上看,龙眼外果皮结构未发生明显的变化,但内果皮细胞结构变化比较明显,从2级果实开始,内果皮开始发生破裂,4级和5级果实的内果皮细胞骨架完全发生瓦解,内果皮完全腐烂,有的部位还可以看到菌丝。综合龙眼果肉和果皮的腐烂特征,将龙眼果实划分为6个腐烂等级。 随着腐烂程度的加深,龙眼果实的呼吸速率加快,0级龙眼果实呼吸速率为61.17 mg/kg·hr,4级的龙眼果实呼吸速率达到最大为382.71 mg/kg·hr。龙眼果实过氧化物酶(Peroxidase,POD)和多酚氧化酶(Polphenol oxidase,PPO)活性随腐烂程度加深也增高,腐烂程度达到5级的果皮POD酶活性最高,为15625 U/min·g,腐烂程度达到4级的龙眼果皮PPO酶活性最高,为687.5 U/min·g。而可溶性固形物(Total soluble solids,TSS)含量随腐烂程度加深却呈现降低的趋势。 龙眼果实腐生细菌和真菌的分离和鉴定结果表明,烂果的真菌和细菌数量和种类均多于好果。腐生细菌主要包括藤黄微球菌(Micrococcus lutens)、科氏葡萄球菌(Staphylococus cohnii)、短芽胞杆菌(Brevibacillus choshinensis)和多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa);腐生真菌主要包括粉红聚端孢菌(Trichothecium roseum)和Neofusicoccum parvum。从龙眼果实腐生细菌和真菌的鉴定结果看,未分离到龙眼果实采后病原菌,说明采后病原菌的侵染不是龙眼果实腐烂的主要因素。 3短短芽胞杆菌主要功能成分分析 对短短芽孢杆菌FJAT-0809-GLX活性物质提取方法优化的结果表明,采用大孔树脂法和氯仿萃取法这2种方法提取的短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质的得率和抑菌效果有所不同,大孔树脂法提取的物质得率较高,为1.593 g/L,抑菌效果也最好,抑菌圈直径为27.33 mm。进一步对大孔树脂提取法各因素的优化表明,短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质收集的最佳方案为:将短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵液常温3600 rpm离心30 min,取上清液,按比例与40 g/L大孔树脂AmberliteXAD16混合,28℃,160 rpm振荡4 h后,填柱,并用水洗柱后,采用3倍洗脱体积的丙酮洗脱,收集丙酮洗脱液,40℃旋转蒸发进行浓缩,所得物质即为短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质溶于二甲基亚砜、超纯水,不溶于石油醚。随着处理温度的升高,短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质的抑菌圈直径逐渐减小,在100℃条件下,抑菌圈直径最小,为18.17 mm。在100℃条件下处理0 h、2 h、4 h和6 h后,其抑菌效果逐渐降低,抑菌圈直径分别为20.47 mm、16.67 mm、15.42 mm和13.39 mm。随着pH值的增大,活性物质的抑菌活性有所降低,当pH=7.0时,抑菌圈直径为20.52 mm,当pH=11.0时,抑菌圈直径为18.46 mm。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对青枯雷尔氏菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、茄形镰孢菌、苹果树腐烂病菌和苹果轮纹病菌等6种植物病原真菌都具有较强的抑制作用,对大肠杆菌K88和沙门氏菌ATCC14028这2种动物病原菌也具有一定的抑制作用,对大肠杆菌K88的抑菌效价为29.22 U/mL。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质在三氯甲烷、丙酮、乙醇和甲醇这4种不同有机溶剂中的共有功能成分包括10种,分别为邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、双氢麦角胺、羟苯乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、绵马次酸、3-异丁基-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1, 4-二酮、二乙基二硫代磷酸、3-苯甲基-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1, 4-二酮、4-(乙酰苯基)苯甲烷和尼泊金丙酯。其中,羟苯乙酯和邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯的相对含量较高,对大肠杆菌K88都具有抑菌效果。羟苯乙酯的抑菌效果最好,与硫酸链霉素(5 U/mL)的抑菌效果相差不大(P﹤0.05),抑菌圈直径为17.81±0.28 mm,最低抑菌浓度为1.57 mg/mL,推测羟苯乙酯是其主要的抑菌功能成分。 4短短芽胞杆菌保鲜机理的分析 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对龙眼果实、鲜切苹果和台湾大青枣都具有很好的保鲜效果,对龙眼果实的保鲜率为87.50%,并且可以防止腐生菌的侵染,保持果实色泽,维持可溶性固形物的含量,保持果实的风味。 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX功能成分对龙眼果实腐生真菌和细菌抑菌能力有所不同。羟苯乙酯对腐生真菌和细菌的抑菌能力最大,抑菌圈直径在18.41 mm-31.06 mm之间。 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对龙眼果皮POD酶活性具有一定的抑制作用,当其浓度为150 mg/mL时,抑制率最高,为9.57%。对其功能成分的抑制作用分析表明,在其中起主要作用的为羟苯乙酯,当其为50 mg/mL时,对龙眼果皮POD酶活力抑制率为25.69%,其次为麦芽酚和苯酚。不同浓度短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对二苯代苦昧酰基自由基(DPPH·)均具有一定的清除作用,且在一定范围内短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质清除自由基的能力与其浓度呈明显的量效关系,当其浓度为100 mg/mL时,对DPPH·的清除能力最强,清除率最高为61.35%。在其中起主要清除作用的功能成分为麦芽酚,当其浓度为200 mg/mL时,清除率最高为68.35%。不同浓度短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对羟基自由基(·OH)的清除率也有所不同,其中以7.5 mg/mL时的清除率最高,达到98.20%,在其中起主要清除作用的成分为羟苯乙酯,当其浓度为150 mg/mL时的清除率最高,达到68.38%。 5龙眼保鲜菌剂的研究 将2‰琼脂和2-5%的NaCl添加到龙眼保鲜菌发酵液中制备成龙眼保鲜菌剂,其活菌含量较高,胶悬剂效果最好,质地均匀,无上下分层。 龙眼保鲜菌剂对龙眼果实具有较好的保鲜效果,常温条件下(温度28-32℃,湿度50-70%)贮藏5 d,龙眼保鲜菌剂处理的腐烂率低于对照,仅为32.67±1.20%,对“早钟六号”和“解放钟”枇杷果实也具有较好的保鲜作用,保鲜率在80%-90%之间。此外,该保鲜菌剂还可以降低龙眼和枇杷果实的失重率,防止腐生菌侵染,维持可溶性固形物含量,保持果实风味。在高温高湿条件下,该保鲜菌剂还对不同鲜切水果(西瓜、皇冠梨、苹果、草莓和台湾大青枣)也具有较好的保鲜效果,防止腐生菌的滋生,保持果实色泽和口味。


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