盐胁迫红麻叶片差异蛋白质组学及其抗氧化酶活性的分析

【摘要】：红麻(Kenaf)是锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)一年生韧皮纤维作物,具有耐旱、耐盐、耐贫瘠、生物产量高等特性。巨大的生物产量是树木的3-4倍,极强的二氧化碳吸收能力为森林的4-5倍。我国沿海新垦盐碱地和华北、西北、东北地区的内陆次生盐碱地大量未被开垦,这些盐碱地均可因地制宜种植红麻,利用山地、盐碱地、边杂地种植红麻成为低碳产业发展的重要方向。 本研究重点用蛋白组学方法鉴定红麻抵御盐胁迫的相关功能蛋白,并初步了解其功能,拟探明红麻抵御盐害的蛋白质水平上的机理。此外,也进一步分析了盐胁迫条件下红麻抗氧化酶系统活性的变化趋势,以及它们之间相互协调作用的关系,这些都为进一步研究红麻耐盐分子和生化机理和为盐碱地利用及指导红麻生产栽培提供理论基础。 本研究首先建立和优化了红麻双向电泳体系。以福红952新鲜叶片为材料,分别采用了TCA-丙酮法、尿素-硫脲法、酚抽提法提取叶片蛋白,在蛋白提取效率,单向和双向电泳图谱等方面比较了这三种方法的提取效果,同时还从IPG干胶条pH范围选择、上样方式、上样量、分离胶浓度这几个主要方面优化了体系。结果表明:用酚抽提法提取的蛋白纯度较高,单向和双向电泳图谱效果较好,获得了26条蛋白质条带和1436个蛋白质点。红麻蛋白主要分布在pH4~7范围内,采用主动水化上样,上样量为1.4mg,12%的分离胶来分离可得到蛋白点清晰,分布均匀,背景清楚的凝胶图谱。 接着利用优化后的蛋白组学双向电泳体系来研究盐胁迫下红麻的差异蛋白。将福红952幼苗分别在0、70、140、200 mM NaCl的半强度Hoagland营养液下处理6 d后,用酚抽提法提取叶片蛋白,蛋白用双向电泳分离(pH4-7胶条,12.5%gel)。实验最少进行三次独立重复,用ImageMaster 7.0软件分析得知:平均每块凝胶大约有1000个蛋白点成功匹配,在表达量大于2倍和Anova 0.05条件下可得到62个表达差异点,经MALDI-TOF质谱分析共鉴定出放氧增强蛋白、小热休克蛋白、脱氢抗坏血酸还原酶、硝酸还原酶、超氧化物歧化酶等42个差异蛋白,其中S-腺苷甲硫氨酸依赖甲基是经胁迫诱导产生的,36个蛋白在盐胁迫下表达量有所上调,6个蛋白下调。这些蛋白按主要功能可分为物质代谢、蛋白合成与降解、细胞防御、细胞生长、离子转运、光和作用等。果糖二磷酸醛缩酶表达量的下调影响了糖和淀粉的合成和积累,这可能导致红麻生长受抑制;1,5-二磷酸核酮糖羧化酶和与光和作用相关的蛋白上调加强了红麻在逆境下的光呼吸来抵御盐害;超氧化物歧化酶表达量上调,使红麻清除细胞内的自由基能力提高。差异蛋白参与代谢过程有些是一种普遍的胁迫反应,来帮助红麻在逆境条件下生存,也有些代谢过程会有助于减少盐胁迫产生的负面的生理影响。红麻可以在盐胁迫下,经过多种途径来调节盐胁迫反应蛋白,从而影响代谢模式、细胞功能、细胞防御以维持相对的离子平衡和生长。 最后,进一步分析了不同盐胁迫条件下红麻叶片的抗氧化酶活性的变化。将红麻幼苗在0、140 mM NaCl的半强度Hoagland营养液下分别处理3、6、9 d和在0、70、140、200 mM NaCl的半强度Hoagland营养液下处理6 d,分别测定植株鲜重、根长、茎长、叶片H2O2、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性。实验表明,盐胁迫下,红麻幼苗生长的受抑制程度基本上随胁迫时间和盐浓度的增加而加重。叶片中MDA和H2O2的含量也随胁迫时间和盐浓度的增加而增加。SOD活性,在盐胁迫下波动并不明显,甚至出现降低;POD活性出现先减后增的变化,且基本上都低于对照;CAT和GR活性都高于对照,且均与胁迫时间和盐浓度成正相关。CAT和GR可能在红麻幼苗应对盐胁迫时起较重要生理生化应激调控作用。然而,植物细胞内各种抗氧化酶并不是孤立的,而是相互联系,相互作用,彼此构成一个复杂的抗氧化网络来维持活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。