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丁香假单胞菌极毛蛋白HrpA的克隆表达与单链抗体的制备

刘海荣  
【摘要】:大多数的植物病原菌如Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas和Ralstonia都含有hrp基因(hypersensitive response and pathogenicity genes)。这些病原菌的hrp基因不仅控制着在宿主植物上引起致病性,而且控制着在非宿主植物上引起超敏反应(hypersensitive response)。病原菌在侵入植物细胞时,hrp基因簇中的结构基因编码的蛋白质,会在病原菌表面形成一种丝状的类似鞭毛的附属物,称为Hrp极毛(Hrp pilus)。病原菌能否使亲和性的植物发病与其有无Hrp极毛有直接的关系,Hrp极毛在植物与病原菌的相互作用中扮演十分重要的角色。 我们通过NCBI找到P. syringae pv. tomato DC3000的Hrp极毛蛋白HrpA的序列,将其克隆到pET32a(+)载体上,制备人工表达的HrpA蛋白抗原,在后续试验中,我们需要测定免疫小鼠的血清效价,为排除融合蛋白硫氧还蛋白(Trx)的干扰,我们又把它克隆到pET28a(+)载体上,并表达纯化目的蛋白用于检测。 以纯化的目的蛋白(由载体pET32a(+)-HrpA表达)免疫Balb/c雌性小鼠,达到一定效价后,提取脾脏总RNA经反转录得到cDNA,扩增得到VL和VH,通过组装得到scFv基因。然后将其构建到噬菌体载体pCANTAB-5E上,建立噬菌体单链抗体初级文库。通过富集淘选过程后,最终选出亲和力最高的单链抗体,命名为SF1,最后在HB2151中进行了可溶性表达,为进一步转植物和植物抗体的研究提供了材料。


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