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南大西洋深海硫氧化细菌的分离鉴定与多样性初步分析

李少能  
【摘要】:海底热液系统及其相关的现象是20世纪自然科学界最重大的发现之一,也是生命科学研究的热点和前沿之一。研究发现在海底热液区存在大量的硫化氢或单质硫的释放。在热液区有大量的硫氧化菌(Sulfur Oxidizing-Bacteria,SOB)利用H2S、单价硫或硫代硫酸盐作为能源,且能与海底底栖生物形成共生体进行生长,它们介导能量的转移,从而使地热能流向更高的营养级。目前研究表明在热液生态系统中硫氧化作用是最重要的能量代谢方式。 本研究基于微生物分子生态学方法,对南大西洋参与硫氧化微生物进行了多样性研究。选取2011年“大洋一号”考察船22航次第三和第四航段获得的10个样品,包括热液硫化物及其附近沉积物样品,以硫代硫酸钠、单质硫或硫化氢作为电子供体,在好氧,微好氧(6%O2),厌氧条件下,利用不同培养基分别在25℃和60℃下进行硫氧化细菌的分离培养。总共分离得到121株细菌,去除同一站位的相同菌株余下108培养单菌,所分离菌株与模式菌株的16S rRNA基因序列相似性在96.649%-100%,包括28个不同的属,其中变形菌是主要的类群。不同培养基分离到的菌株的种属差异较大。采用M1培养基共获得11个不同属,其中,Thalassospira和Citreicella属是优势菌群,分别占23%和18%;采用M2培养基获得7个属,其中Marinobacter占45%,是优势菌群。采用M3培养基得到的菌株数最多,共有18个属,Martelella属是优势菌群,占16%;M4培养基获得7个属,Citromicrobium和Novosphingobium是主要类群。通过BOX-PCR对这些主要的种属的分离细菌进行遗传多样性分析,其中属于Pseudomonas属的细菌菌株间的差异较大,其余种属相对较小。对获得的3个高温厌氧富集菌群(4A3Y、4B3、7A3Y)进行了16sRNA基因的多样性分析,经过Operational Taxonomic Unit (OTU)归类和比对分析,Firmicute为主要类群。4B3文库多样性最低,仅包括3个OTUs并与相同站位的另一富集菌群4A3Y有很大的差异。其中OTUs主要与Caloranaerobacter azorensis MV1087、Desulfotomaculum halophilum SEBR3139及Hafnia paralvei ATCC29927同源性最高。从富集菌群组成结构分析推测,相比硫氧化特性,高温对微生物的选择压力更大。 通过对分离单菌进行营养方式分析,判断分离株是否有为化能自养菌。为检测其无机碳的同化潜力,对参与Calvin循环的RuBisCO(核酮糖二磷酸羧化酶)关键酶(Ⅰ型和Ⅱ型)的编码基因cbbL、 cbbM基因进行扩增;同时,结合异养培养基平板生长及生长曲线的测定,发现部分菌株具有CO2固定能力或比较弱的RuBisCO活性。此外,对分离菌株的硫氧化特性进行初步分析,平板生长pH改变结果表明大部分菌株属于产酸硫氧化菌;对参与硫氧化代谢的关键基因soxB进行扩增,仅部分属于Labrenzia属的菌株得到扩增,推测原因可能是大多数菌株SoxB基因的差异性较大或者利用其他的硫氧化代谢途径;同时研究不同浓度硫代硫酸钠对各菌株生长的影响,首次发现某些菌株能被硫代硫酸钠刺激生长,包括可能具有烃类降解功能的菌株食烷菌(L10M1-6)、新鞘氨醇菌(L10M1-7)、海杆菌(1A2-1、1A2-3),说明这些菌株代谢多样,同时暗示了这种代谢多样性有助于适应热液生烃又产硫化氢的热液区环境。 总之,我们利用不同培养基和培养条件结合16S rRNA文库分析,初步分析了南大西洋硫氧化细菌多样性,获得了多株硫氧化菌株;这些细菌的硫氧化机制和代谢途径以及它们在热液环境中如何参与硫循环的功能还有待于进一步的深入研究。


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