杜鹃黄酮类化合物活性成分的动态变化及诱导子对其含量和相关酶活性影响的研究

【摘要】：杜鹃花属是杜鹃花科中最大的一个属，而我国又是杜鹃花属植物种类最丰富的国家，是世界杜鹃花属植物的主要分布中心。该属植物除了具有极高的欣赏价值外，还具有较高的药用价值，在医药、食品等具有广阔的开发应用前景。黄酮类化合物是植物中重要的次生代谢产物，而杜鹃属植物是一种优良的类黄酮潜在资源。但是目前对杜鹃各方面的研究和开发主要是以野生品种为主，而由于对野生品种的盲目采集，导致杜鹃自然资源严重匮乏，可供利用的野生杜鹃资源越来越少，且目前对杜鹃黄酮类化合物也没有一个系统的研究，限制了人们对杜鹃属黄酮类化合物潜在资源的进一步开发和利用。本论文以目前人工栽培非常成功的锦绣杜鹃、白杜鹃等为材料，对杜鹃中黄酮类化合物进行了系统研究，为进一步利用栽培杜鹃的黄酮类化合物提供了重要的理论依据和技术支撑，同时也为今后黄酮类化合物扩大生产提供了资源保障。 本文主要研究内容有：（1）将BP人工神经网络技术与传统的正交试验方法相结合对杜鹃黄酮类物质提取工艺进行优化，并对优化后杜鹃总黄酮提取液进行抑菌实验；（2）采用颜色反应、高效液相-质谱联用技术等分析方法分析杜鹃叶和花中黄酮类化合物的主要成分；（3）应用HPLC法，建立了同时测定杜鹃提取液中4种主要黄酮类成分的测定方法，同时，用建立的HPLC方法对锦绣杜鹃和白花杜鹃叶、枝的黄酮类主要成分含量的年动态变化进行分析研究；（4）研究不同类型不同浓度的外源诱导子对杜鹃黄酮类化合物含量的累积及叶片相关酶活性的影响，选择对黄酮类化合物含量提高最适的诱导子类型和诱导子浓度。主要的研究结果如下： 1、在正交试验的基础上，应用BP人工神经网络模型确定锦绣杜鹃叶黄酮提取的最优化工艺：料液比1：20，超声波提取时间为40min，提取温度为50℃，乙醇质量分数为40%。应用优化工艺提取的总黄酮含量高于正交试验各结果，且节约了成本，降低了能耗。表明将BP人工神经网络技术与传统的正交试验方法相结合提出的试验设计和数据处理的方法是可行的，该原理和方法也可用于其他植物黄酮类物质提取工艺的优化。 2、锦绣杜鹃和白杜鹃叶总黄酮提取液对青霉菌、黑曲霉等霉菌几乎无抑菌作用，对细菌则有不同程度的抑制作用，原液抑菌率都达到100%。其中对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌次之，并且都随总黄酮提取液浓度的提高，抑菌效果增强。而白杜鹃叶总黄酮提取液的抑菌效果要好于锦绣杜鹃叶的，这可能是与其提取的总黄酮含量的高低有关。锦绣杜鹃叶总黄酮提取液的最低抑菌浓度（MIC）：金黄色葡萄球菌抑菌和大肠杆菌为0.03125g/ml，枯草芽孢杆菌为0.0625g/ml。白杜鹃叶总黄酮提取液的最低抑菌浓度（MIC）：金黄色葡萄球菌抑菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均为0.03125g/ml。 3、本文用Waters C18(4.6mm×250mm，5μm)反相色谱柱，在甲醇和水的流动相梯度洗脱，洗脱程序为：0~24min，31%~42%B；24~30min，42%~50%B；30~35min，50%~60%B；35~40min，60%B；检测波长356nm，流速为0.7mL/min，柱温30℃条件下可以使锦绣杜鹃叶中的黄酮类化合物HPLC得到很好的分离效果。在HPLC分离的基础上，通过液质联用技术初步鉴定了杜鹃叶中的5个黄酮类化合物，分别是金丝桃苷、异槲皮苷、广寄生苷、槲皮苷、槲皮素。杜鹃花中的6个杜鹃花黄酮类化合物，分别为锦葵花素戊糖苷、杨梅黄素3-鼠李糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-O–阿拉伯糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷槲皮素。 4、锦绣杜鹃叶总黄酮及黄酮主要成分含量的季节变化变化规律呈现出一定的相似性，黄酮含量随着春季气温回升，芽的发育，新枝叶的生长，黄酮的含量大幅度增加，在3~6月份杜鹃叶总黄酮含量均表现出较高水平，进入9月，总黄酮含量又有所回升，11月总黄酮大幅度下降。锦绣杜鹃叶四种主要黄酮类成分中槲皮苷含量最大，其次为槲皮素，最少为异槲皮苷。锦绣杜鹃枝总黄酮含量的季节性变化规律与叶有所不同，枝在进入9月份时，并没有象叶一样进入第二个黄酮的增长期，这可能与枝的含量太低，变化不明显有关，且杜鹃枝含量明显低于叶。白杜鹃枝叶总黄酮与其主要成分含量的季节性变化规律同锦绣杜鹃枝叶呈现出一定的相似性，但白杜鹃枝叶黄酮类化合物含量较高于锦绣杜鹃。 5、不同浓度的SA处理，杜鹃总黄酮及主要成分含量均在处理第8天时，达到最高值。其中低浓度的SA (50μg/mL)对黄酮含量的影响最明显，高浓度的SA起抑制作用。PAL活性随着诱导子处理时间的增加而增加，且在第4天和第8天PAL活性均达到较高值，说明SA处理后，PAL活性维持较高水平的时间较长。100μg/mL浓度的SA处理，PAL活性增幅最大。50μg/mL浓度与100μg/mL浓度的SA处理后，PPO活性都有较大幅度的提高。POD活性在第4天就达到较高值，这可能与其对外界刺激作出的应激反应有关.研究结果说明不同浓度的SA处理对POD活性都有显著提高，是提高POD活性较好的诱导子。 6、一定浓度的外源MeJA诱导子处理，杜鹃总黄酮及主要成分含量的影响显著，其中高浓度的MeJA(150μg/mL)对总黄酮及主要成分含量的影响最明显，但低浓度(50μg/mL)的MeJA对杜鹃黄酮含量基本没有影响。100~200μg/mL浓度的MeJA处理后，PAL活性都显著提高，说明对杜鹃喷施100μg/mL-200μg/mL浓度范围的MeJA后可显著提高PAL酶活性。100μg/mL浓度的MeJA处理后，PPO活性提高最明显。POD活性在第4天就达到最高值，且各处理POD活性均有大幅度的提高，这说明不同浓度的MeJA处理对POD活性都有显著提高，也是提高POD活性较好的诱导子。 7、不同浓度的GA3处理杜鹃植株，浓度为100μg/mL的GA3处理对杜鹃总黄酮含量的影响最明显。而高浓度的GA3（200μg/mL）对杜鹃黄酮含量基起到抑制作用。不同浓度的MeJA处理对黄酮类4种成分含量的影响不同，金丝桃苷、槲皮苷2种黄酮类成分含量提高幅度最明显的处理浓度均为100μg/mL。而异槲皮苷和槲皮素2种黄酮类成分含量提高幅度最明显的处理浓度却为150μg/mL。50μg/mL、100μg/mL浓度的GA3处理后，对PAL活性的影响较为显著，PAL活性维持较高水平的时间较长。100μg/mL浓度的GA3处理后，PPO活性提高的幅度最显著。低浓度的GA3（50μg/mL）处理后，POD活性在处理第4天后有较大幅度的提高，其余浓度的GA3处理，反而降低了叶片POD的活性。、 8、不同浓度的ABA处理杜鹃植株，结果表明，浓度为150μg/mL的ABA处理对杜鹃总黄酮及主要成分含量的影响较为显著。低浓度（50μg/mL）的ABA处理，PAL活性增加幅度最大。100μg/mL浓度的ABA处理后，PPO活性提高的幅度最明显，且在处理后第12天PPO活性还保持一定的水平，对PPO活性影响最少的浓度是50μg/mL。而对POD活性影响较大的浓度则是200μg/mL和150μg/mL。而50μg/mL和100μg/mL浓度的ABA处理，POD活性反而下降。结果表明，高浓度的ABA对POD活性起到提高作用，但低浓度的ABA对POD活性反而起到一定的抑制作用。