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草菇同核、异核菌株间差异基因表达的研究

刘朋虎  
【摘要】:在我国目前广泛栽培的20多种食用菌中,草菇[Volvariella volvacea (Bull.exFr.) Sing.]产量居第八位,具有重要的经济价值。草菇杂交育种的结果表明,能出菇的草菇菌株为一些稳定遗传的异核体,但是目前对草菇异核体形成的分子机制还是空白。对草菇异核体形成的分子机制展开深入研究,对于揭示草菇的遗传规律,指导草菇的分子育种具有重要的理论意义及潜在的应用价值。本实验室前期从福建省主栽品种之一屏优一号(PY)分离到2株形态不正常且均不可孕单孢菌株PYd15、PYd21,二者配对杂交获得可正常出菇的菌株H1521。分子标记检验结果表明,H1521具有PYd15、PYd21的遗传物质,是一个异核菌株。以同核菌株PYd15、PYd21及异核菌株H1521为研究材料,本研究主要从转录组和蛋白质组水平分析了同核菌株与异核菌株的基因表达差异,为探讨草菇异核体形成的分子机制奠定理论基础。本文的主要研究内容有: (1)采用Solexa测序技术对同核菌株PYd21基因组进行了从头测序(denovo sequencing),测序完成后对测序数据进行了组装、拼接及基因注释。经soapdenovo软件组装,最终获得302条Scaffold,Scaffold总长为37200239bp(基因组长度),最长和最短的Scaffold分别为1845736bp和1003bp。经过Augustus(version2.1)基因预测软件预测共获得11534个基因,GC含量为50.86%,基因平均大小为1459bp,基因总长为16837461bp,占整个基因组的45.26%。酵解途径基因注释表明,草菇中存在完整的糖酵解途径基因,从6-磷酸葡萄糖到丙酮酸共有10个酶催化,10个酶共注释到11个编码基因。 (2)用Solexa测序技术对草菇菌丝体及子实体各个发育阶段菌柄共8个样品的mRNA混合物进行了转录组测序,8个样品包括同核菌株PYd15、PYd21及异核菌株H1521的菌丝体,H1521出菇后的原基,纽扣期菌柄、蛋形期菌柄、伸长期菌柄、成熟期菌柄。测序完成后对测序结果进行了组装、拼接、基因注释及生物信息学分析。经过基因组装、拼接及注释,获得34287个Unigene,Unigene的平均长度为557nt。将获得的Unigene与COG数据库比对后,共有12666个基因被比对到,涉及25个功能类别;通过KEGG注释,共有9300个Unigene被注释,被Unigene注释到的Pathway有105个。 (3)采用Solexa测序技术对同核菌株PYd15、PYd21及异核菌株H1521进行了数字基因表达谱测序(DGE),以(1)、(2)获得的基因库为参考基因进行了基因注释,并对同核、异核菌株的差异表达的基因进行了生物信息学分析。测序结果表明,PYd15、H1521、PYd21文库中得到的高质量测序标签(Clean Tags)总数分别5753854、5701781和5950904,对应的标签种数(Distinct Tags)分别为86772、85626和106250。最终,在PYd15、PYd21及H1521文库中,分别获得了13667、14389、13780个转录本;经过严格的计算方法,在PYd15vs H1521与PYd21vs H1521比对组中,分别获得了2053、4678个差异表达的基因。这些差异表达的基因代表了草菇同核菌株与异核菌株之间差异的分子基础。对差异基因进行GO功能富集分析的结果表明,在PYd15vs H1521比对组中共发现11个显著富集的GO条目,在PYd21vs H1521比对组中没有被显著富集的GO条目。Pathway显著性富集分析结果表明,在PYd15vs H1521比对组中,共得到4个显著富集的pathway,在PYd21vs H1521没有得到显著富集的pathway。 (4)利用iTRAQ标记结合2D-LC MS/MS技术对草菇同核菌株PYd15、PYd21及异核菌株H1521进行了差异蛋白质组学研究,对同核菌株与异核菌株之间的差异蛋白质进行了鉴定,对鉴定的差异蛋白进行了生物信息学分析。最终,共得到2335个不同肽段,1039个蛋白被鉴定,得到了1030个蛋白质的相对定量信息。同核、异核菌株之间差异蛋白分析结果表明,同核与异核菌株的差异蛋白总数为115个,两个同核菌株与异核菌株共同的差异蛋白45个,上调蛋白23个,下调蛋白22个。 (5)对草菇糖酵解基因的结构及在同核、异核菌株中的表达量进行了研究。根据基因组序列设计引物对PYd15、PYd21中糖酵解途径的7个基因进行了克隆测序,比对结果表明7个基因序列在2个菌株中序列完全一致,没有多态性。利用转录组数据对7个基因的结构分析,结果表明:糖酵解7个基因长度在1015bp-3494bp之间,内含子数量在5-13个之间,在RNA加工过程中,7个基因均存在内含子保留的可变剪切类型,有3个基因存在可变的3,端可变剪切类型。统计数字基因表达谱中7个基因在PYd15、PYd21及H1521中的表达量,除PGM基因外,其他基因在异核菌株中的表达量均远远高于同核菌株,异核菌株中基因表达具有协同增效作用。采用实时荧光定量PCR技术检测7个基因在3个菌株中的表达量,所有基因在异核菌株中的表达量均高于同核菌株。糖酵解基因在同核、异核菌株中的表达量与菌丝生长速度具有显著正相关性,表明在异核菌株细胞中来源不同的两种细胞核存在相互作用,使得糖酵解基因表达量提高,糖酵解加快,从而菌丝具有更快的生长速度。


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