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高产5-氨基乙酰丙酸菌株的筛选及发酵条件优化

李昂  
【摘要】:5-氨基乙酰丙酸(ALA)广泛存在于微生物、植物和动物细胞内。它是血红素、卟啉、叶绿素和维生素B12等四吡咯物质合成的前体物质。低浓度的ALA可以作为植物生长调节物质提高作物的品质和抗逆性,延长农产品货架期;高浓度的ALA可以作为除草剂广泛使用;同时在医药领域,ALA作为一种光敏物质受到广泛的关注,目前很多关于其治疗癌症等疾病的报道。而目前ALA的生产主要依赖于化学合成,面对ALA的日益增长的需求量,寻找一种可以高效积累ALA的微生物成为目前研究的重点。 ALA水溶液随着pH值的升高,其稳定性迅速下降,在成分复杂的发酵液中受到多种物质影响,更容易导致其快速分解,因此维持发酵液酸性环境对于ALA的保护极为重要。目前缺少高效液相色谱法用于检测和鉴定溶液中ppm级的ALA。本文从菌株的分离与筛选及ALA的检测方法进行了研究,主要的研究内容如下 1、摸索了柱前衍生反相高效液相色谱法对于痕量ALA的检测方法,并进行了检测方法优化,结果表明,改变柱前衍生温度、检测波长和流动相的pH值可以显著提高检测灵敏度,经过优化可将ALA检测灵敏度提高到5mg/L。 2、从不同生态环境中分离到10株能积累ALA的菌株,其中四株的ALA产量大于1.5mg/L,对这四个菌株进行16S rDNA基因序列分析以及磷脂脂肪酸分析,给合形态学特征和生理特征,确定了它们的分类学地位。其中ALA产量最高的菌株LA-10鉴定为孔氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii),发酵周期为24h,ALA产量高达6.88mg/L,且发酵结束后发酵液处于酸性环境中(可防止ALA快速分解)。 3、对LA-10菌株进行培养基响应面以及发酵条件的优化,实验结果表明,LA-10最佳发酵条件为:初始pH值为5.0,250mL的三角瓶中装液量为80mL,摇床转速为100rpm,接种比例为1%,发酵时间为24h;最佳培养基组成为:牛肉膏6.14g/L、葡萄糖6.97g/L、胰蛋白胨5.15g/L、硫酸镁1g/L、氯化钠1g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L。在最适条件下,其产量提高到19.8mg/L。并进一步对LA-10发酵液中ALA的成分进行了反相高效液相色谱法验证,为LA-10菌株的进一步研究和开发奠定基础。


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