葡萄糖对水源性肠球菌抗生素耐药形成的影响

【摘要】：目的：通过建立模型生态系统进行研究，了解葡萄糖引发系统中的肠球菌对红霉素、环丙沙星、土霉素、氨苄西林、万古霉素耐药的表型的影响，探讨葡萄糖引发系统中的肠球菌对红霉素和环丙沙星耐药产生的机理。 方法：（1）土壤的采集：作为底泥的土样采自福州市森林公园，采样点选择游人很少经过的地方。（2）分离土壤中的肠球菌并检测MIC值是否处于敏感的范围，是否可以作为底泥。（3）模型生态系统的建立：建立12个模型系统，分别为0.02g/L、0.1g/L、0.4g/L、1.6g/L、3.2g/L和0g/L，每个剂量设置两个重复加入经过高压灭菌的葡萄糖。（4）耐药表型检测：依次采取0d、1d、8d、16d、28d、40d、86d和140d模型系统中水和底泥交界处的混合物，经培养分离纯化后检测肠球菌对6种抗生素的敏感程度，了解葡萄糖对肠球菌产生抗生素耐药表型变化造成的影响；检测系统各个阶段的溶氧、pH、温度变化，了解添加葡萄糖对水源性肠球菌分离率等的影响。（5）耐药基因检测：检测分离纯化得到的肠球菌ermB、mefA、gyrA以及Esp等基因，对gyrA基因进行测序，分析83和87位点有无突变产生。 结果:(1)添加不同剂量葡萄糖对肠球菌分离率的影响不同，添加量在一定范围内可以显著提高肠球菌的分离率；添加0.02g/L剂量可以使系统中的肠球菌分离率从20%提高到90%；添加0.1g/L和0.4g/L剂量组也有不同程度提高；而添加1.6g/L和3.2g/L的剂量组在16d到28d分离率有下降。 (2)添加不同剂量葡萄糖没有引发肠球菌对氨苄西林和万古霉素的敏感性产生可检测到的影响。0.02g/L剂量在第8d出现了环丙沙星耐药菌株，并在28d达到最高的57.1%；到140d仅有40%菌株表现为中介，无耐药菌株。0.1g/L剂量在第8d耐药和中介菌株分离率均降到零，而后又呈上升趋势，到140d添加0.1g/L-3.2g/L葡萄糖对环丙沙星的耐药性的影响都比较明显，总的来说葡萄糖的添加剂量越大影响就越大，剂量较大的组耐环丙沙星的菌株的出现时间较早，耐药率也较大。第1d3.2g/L剂量产生的耐药率最高，为60%。0.02g/L剂量在第8d也出现了耐药菌株，并还维持在33.3%。0.4g/L和1.6g/L剂量组均在1d就产生了耐药菌株，并在16d和28d达到最高，而后又都有所下降。3.2g/L剂量组耐药菌株出现较快，第一天耐药率就达到了60%，并且维持了15d；第86d又出现了12.5%的耐药率和37.5%的中介率；到140d耐药和中介菌株均没出现。不同的添加剂量对氯霉素耐药产生的影响也不同，系统中只有0.02g/L和3.2g/L剂量组对氯霉素产生了14.3%和37.5%的耐药率。系统中分离得到的肠球菌对红霉素以及土霉素的耐药菌株出现的都比较晚，而且程度不完全与添加剂量呈正比。 (3)分离得到的对红霉素耐药的44株肠球菌中，ermB基因的阳性率为63.6%（28/44），ermB基因呈阳性的菌株中，耐256μg/mL和128μg/mL浓度红霉素的肠球菌有24株，可见对红霉素耐药程度越高越容易出现ermB耐药基因；对红霉素敏感的16株肠球菌均未检测到ermB耐药基因的存在。试验中介导对红霉素耐药的mefA基因仅在中介菌株中检测到一株。肠球菌的gyrA基因试验共检测72株，其中60株显示为阳性，对其进行测序分析发现该基因的83和87位点没有突变的产生。对耐药菌株进行检测没有发现与肠球菌表面蛋白表达有关的Esp基因。 结论：(1)一定浓度的葡萄糖可以引发模型中肠球菌产生红霉素、环丙沙星、氯霉素和土霉素耐药，对肠球菌万古霉素、氨苄西林耐药的产生无明显的作用。 (2)模型系统中的葡萄糖浓度不同，对肠球菌对环丙沙星、红霉素、氯霉素和土霉素的影响程度不同；对氯霉素耐药的形成影响不大。 (3)本试验模型生态系统中的肠球菌的对红霉素耐药与ermB基因的存在有很大关系，而基因测序结果表明gyrA基因的第83和第87位点均未发生突变，说明系统中肠球菌对环丙沙星耐药的形成的原因并不是gyrA基因突变。 (4)检测表明本试验耐药菌株中没有出现Esp和mefA基因，说明模型中肠球菌耐药的形成与这两种基因引起的耐药机理无关。