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结核分枝杆菌HtpG蛋白的表达纯化、结晶及其与CrRNA的相互作用

王跃  
【摘要】:目前由世界卫生组织报道,在2010年,全世界900万人患结核病,140万人死亡,而这其中95%发生在发展中国家。我国每年新发结核病人数占全球总数的17%,位居世界第二。因此,对于结核病的病原体——结核分枝杆菌——的致病机理以及免疫机制展开深入研究显得尤为重要。 HtpG是原核生物重要的分子伴侣,在抵御外界压力的过程中有着重要的作用。它是hsp90的原核同源物。Hsp90使生物有效抵御环境压力。其独特的性质使它成为治疗的良好分子靶点。对于HtpG及其在结核分枝杆菌中的深入研究可以对结核病的治疗以及防治提供新的思路。 CRISPR系统是结核分枝杆菌中的一种适应性免疫系统,对菌体消灭外来质粒和噬菌体以及抵抗和阻止质粒及噬菌体的繁殖有着不可忽视的作用。近年来有报道称,HtpG对大肠杆菌中的CRISPR/Cas(CRISPR-associated)系统是必需的。如果HtpG缺失,CRISPR系统将丢失在溶原作用中抵御噬菌体的感染的自杀行动并且丢失了免疫能力。然而,当HtpG被回补后,CRISPR/Cas系统丢失的活性得到了恢复。 依据现有的一些研究成果,预测结核分枝杆菌中同样存在CRISPR系统,并且HtpG对CRISPR系统的活性有作用。结核分枝杆菌中Rv2299c基因对应的蛋白即HtpG。本文据此,在生物信息学分析的基础上,提取结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板,对结核分枝杆菌H37Rv标准株中的Rv2299c基因进行克隆以及融合表达,构建了原核重组表达质粒pET28a-Rv2299c,并且在原核中高效表达。对纯化后的融合蛋白进行了结晶实验,初筛长出来了棒状晶体。同时,将Rv2299c连接到了穿梭载体pMV261H中,并转入了耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis),采用抗his标签的抗体检测重组子已正确表达HtpG蛋白。 在CRISPI数据库得到结核分枝杆菌H37Rv的CRISPR的预测序列,选取一段CRISPR的序列,在RNA fold web server中预测其RNA二级结构。通过合成模板,PCR扩增后在体外转录成RNA。RNA经过纯化后将其进行去磷酸化处理,使用T4多聚核苷酸激酶在5’端加上γ-~(32)P ATP标记后,与HtpG蛋白进行孵育。经非变性胶检测,放射性显影确定了HtpG蛋白和所选取的CRISPR的序列有相互结合的作用。


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