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小菜蛾卵黄原蛋白基因的克隆、表达模式与功能分析

邹明民  
【摘要】:小菜蛾(Plutella xylostella L.),是世界性的对十字花科蔬菜具有毁灭性危害的重要害虫,给全球带来了严重的经济损失。而长期不合理的使用化学农药,加剧了小菜蛾抗药性的发展,使其几乎对每一类化学药剂都产生抗药性。针对小菜蛾目前仍缺乏直接、安全、有效的控制策略的实际需求,围绕生殖调控决定昆虫生殖潜能与适应性这一科学问题,以生殖调控的基础物质卵黄原蛋白基因Vg为核心,采用解剖形态学、分子生物学与实验生物学等技术与方法,重点研究:(1)小菜蛾雌性生殖系统结构及其卵巢发育动态;(2)小菜蛾Vg基因的分子结构特征及其表达模式;(3)Vg基因在小菜蛾生殖调控中的作用。本研究旨在明确Vg基因对小菜蛾生殖潜能与适应性的影响。主要结果如下:1.小菜蛾雌性生殖系统结构与卵巢发育动态小菜蛾雌性内生殖系统主要由卵巢(含8根卵巢管)、侧输卵管、中输卵管、生殖附腺、交配囊和受精囊组成。通过观察蛹期不同时段和成虫卵巢内卵子形态和卵黄沉积的变化,可将小菜蛾卵子形成分为3个时期:卵黄发生前期(蛹期第1天)、卵黄发生期(蛹期2-3天)和卵黄发生后期(卵成熟期)(初羽化成虫)2.小菜蛾Vg基因的分子结构特征与表达模式小菜蛾Vg开放阅读框全长5217 bp,预计编码1738个氨基酸,其理论分子质量为197kDa,理论等电点p1为6.13,其中,丙氨酸(Alanine)和丝氨酸(Serine)含量相对较多,分别为150个(含量为8.6%)和130个(含量为7.5%)。该蛋白包含3个保守结构域vitellogenin_N (Vg-N)、DUF1943、von Willebrand factor type D domain (vWD),以及1个特殊结构域Zn-finger。小菜蛾Vg蛋白序列含4个可能的切割位点RNER、RARR、RLAR、RLAR。同时,在小菜蛾Vg氨基酸序列C端也具有多个重要的昆虫卵黄原蛋白保守基序,如DGXR、GI/LCG和半胱氨酸残基,但小菜蛾GI/LCG基序中发生了一个氨基酸突变,为GVCG,且在小菜蛾Vg氨基酸序列中并未发现聚丝氨酸序列。通过软件预测得出小菜蛾Vg蛋白含有6个糖基化位点和120个磷酸化位点。小菜蛾Vg氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫有较高的相似性,与柞蚕Anfheraea pernyi、长尾水青蛾Actias selene、月神蛾Samia cynthia的相似性分别为40.3%、41.2%、40.5%。实时荧光定量PCR结果表明,在小菜蛾雌虫各个发育阶段均能检测到Vg表达,但在化蛹前其含量相对较低,雌虫羽化后24 h内达到最高,之后呈逐渐下降的趋势。3.Vg基因RNAi对小菜蛾繁殖力的影响使用合成的Vg siRNA注射小菜蛾雌蛹,注射后的24 h内Vg的表达受到明显抑制。对注射siRNA的小菜蛾繁殖力进行评估,初步结果显示,小菜蛾羽化5天内的总产卵量显著下降,总的卵孵化率并没有显著差异。本研究在实践上有助于筛选控制小菜蛾的潜在靶标与最佳时段,为有效防治和持续控制小菜蛾种群暴发与危害提供创新思路和途径。


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