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龙眼胚性培养物抗性相关基因的克隆与功能鉴定

叶炜  
【摘要】:龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是热带亚热带重要果树,具有很高的营养价值。龙眼易受超过20种采前和采后病害的影响,随着全球性的对环境及食品安全的日益重视,培育减少化学农药依赖的新型品种是农作物育种的重要方向。但龙眼育种周期长,抗性育种进展缓慢,对龙眼抗性机制产生的分子机理所知甚少。此前,我们进行了龙眼胚性培养物的转录组高通量测序,从中发现大量植物-病原物互作相关基因的表达,其数量占所有Unigene的8.15%,这为快速获取龙眼抗性相关基因信息奠定了基础。本文拟在此基础上,利用同源克隆结合生物信息学的方法挖掘鉴定龙眼转录组中的NBS-LRR抗性基因、抗性相关激素信号基因以及具有广谱抗性特性的铁氧还蛋白家族基因,并通过进一步的生物信息学、qPCR定量表达和转基因异位表达分析,进行基因的功能验证,为龙眼及其他物种的抗性育种提供科学依据。1龙眼抗性基因的同源克隆NBS-LRR基因是抗性基因(Resistance gene, R gene)中的重要类型,通过其保守功能域进行同源克隆可以迅速获得不同物种的R基因信息。通过R基因NBS保守功能域基序P-loop、Kinase-2和GLPL (AL)设计简并引物,回收相应的条带测序,在55个阳性克隆子中,共得到46条序列与已知NBS序列具有同源性,且彼此间没有重复的序列,将46条序列分别命名为NBS(X), 并登录GenBank,登录号分别为JQ900202-JQ900227、JX007920-JX007923、JN398315-JN398318、JN398320-JN398329。将所获得序列的推导氨基酸序列进行多重比对,可见明显的P-loop、RNBS-A、Kinase-2、 RNBS-B 和 GLPL (AL)保守基因,其中,4条序列Kinase-2基序符合TIR-NBS-LRR(TN L)类型R基因特征,42条序列符合CC-NBS-LRR(CNL)类型R基因特征。进化树分析显示,46条序列可分为TNL及non-TNL两大类群,其中,non-TNL双可进一步分为4个亚类群。基序分析显示,non-TNLl及non-TNL2类群成员之员较为一致,但没有聚类到已知类型的R基因,可能为龙眼特有的类群。本试验发现,尽管龙眼胚性培养物存在于无菌条件下同,但存在类型丰富的R基因表达,利用简并引物是快速了解在龙眼培养性培养物中所表达R基因类型的快速而有效的方法一。2 龙眼胚性培养物转录组数据库R基因的挖掘尽管利用同源克隆法可对基序较为保守的R基因进行有效的分离,但难以对全基因组或转录组范围内表达的R基因进行较为全面的筛选。本试验通过关键词结合批量BLAST在龙眼胚性培养物转录组数据库挖掘R基因,在全部68925条Unigene中在得到1406条不重复的序列与抗性相关,其中含有NB-ARC结构域的221条,含有TIR结构的40条。通过对相对具有完整NBS结构的73条序列进行进化树分析,发现类群划分与上述同源克隆所获得序列进化树分析结果相似。所有R基因中TNL类群15条,占24.7%,而non-TNL类群的R基因58条,占75.3%。non-TNL1、non-TNL2亚类群无论在序列及基序方面均与现有其他物种R基因呈现较大差异。通过miRNA基因的靶向分析发现,miR482较倾向于靶向较为保守的non-TNL3类群,而miR5018均靶向龙眼中特有的non-TNL1亚类群,而在其他物种中,还未发现miR5018与R基因的靶向关系。利用龙眼胚性培养物转录组进行基因挖掘可以迅速鉴定大量R基因,在龙眼胚性培养物转录组范围内,龙眼R基因主要由non-TNL类型构成。3龙眼抗性基因的全长克隆及病原物侵染下的表达分析为验证所获得的R基因两端序列的类型,以及进一步鉴定R基因的生理功能,本试验通过RACE克隆技术共获得13条龙眼R基因序列全长,GenBank登录号为JQ900226,KP266525-KP266536。通过与其他物种R基因进行比对,发现龙眼R基因与甜橙R基因最为相似,一致性在66-79%之间。生物信息学分析发现,所获得R基因均没有明显的信号肽,但可能定位于不同的细胞器。通过对获得全长及被niRNA所靶向的R基因进行表达分析显示,R基因在叶片中的表达量显著高于在龙眼胚性愈伤组织中的表达量,并且多数R基因在病原物侵染后呈现表达量的提高,其中,被niRNA预测靶向的R基因在病原物侵染后表现更为明显的表达变化;在不同信号激素下,不同成员呈现不同的表达规律。结果表明,龙眼R基因家族庞大,进化程度高,在抗性过程中存在复杂的表达调控网络。本试验通过龙眼R基因特别是不同亚类群R基因全长的克隆及表达分析,初步了解龙眼R基因的组成类型,并为进一步的R基因功能转化鉴定提供了可能。4龙眼抗性相关激素信号标记基因克隆与表达分析在龙眼中,病原物与植株的互作的分子机制还所知甚少,影响了对龙眼R基因的功能鉴定的进行。抗性相关激素信号标记基因的克隆与鉴定是研究植物与病原物互作的良好工具。本试验利用拟南芥水杨酸信号标记途径基因PR1,(AT2G14610)、PR2(AT3G57260)、茉莉酸/乙’烯信号途径标记基因ERF1(AT3G23240)、茉莉酸信号途径标记基因VSP2(AT5G24770)、乙烯信号途径标记基因PDE1.2(AT5G44420)于龙眼胚性培养物转录组挖掘同源序列,并进行全长克隆,共获得9条全长及1条5'序列的水杨酸、茉莉酸及乙烯信号途径标记基因,GenBank登录号为KP266536-KP66545。经BLAST及保守功能域分析,所获得序列均与拟南芥相应标记基因具有一致性。通过荧光定量分析发现,除VSP2-1,所有序列可响应病原物的侵染上调表达。在不同激素处理下,发现龙眼PRl-1、PR2-1、ERF1-2、 VSP2-2、PDF1.2-1与相应的同源拟南芥标记基因较为类似,能特异响应SA、ET及JA信号处理。结果表明,利用同源克隆法可以在龙眼得到特异性响应不同激素的标记基因,是快速获取此类基因的方法一,此类基因的克隆,将对将来R基因功能的鉴定及龙眼与病原物互作的分子机制提供重要的分析工具。5龙眼广谱抗性基因铁氧还蛋白的克隆、亚细胞定位与表达分析R基因通过直接或间接识别病原效应因子,对病原物的识别具有专化性,而铁氧还蛋白作为光合电子传递链的关键蛋白,在多种植物上被证实具有广谱的对抗生物及非生物胁迫的能力。利用数据库基因挖掘并结合RACE技术,本试验获得5条Fd全长基因序列,GenBank登录号分别为JF733784、JF957855、JF957856、JF957857及JF957858。系统进化树分析显示,所获得的铁氧还蛋白分别为叶绿体类非光合类型的Fd3、FdC1、FdC2以及线粒体类的MFDX基因。将Fd3、FdC1导入烟草进行亚细胞定位分析,发现二者均定位于叶绿体,与所预测位置相符。所有类型的铁氧还蛋白在体胚发生过程有类似的表达模式,并在心形胚时期大量表达。6异位表达龙眼铁氧还蛋白文心兰的抗病性与基因表达变化分析利用此前已建立的高效文心兰农杆菌转化体系,将龙眼Fd3、FdCl基因导入文心兰原球茎,通过一系列筛选培养获得再生植株,发现Fd3基因可以提高文心兰对抗软腐病的能力及移栽成活率。印度梨型孢菌是研究植物与菌共生互作的模式菌株,可为共生植株带来广谱抗性。印度梨型孢菌是研究菌与植物共生的模式菌株,能为寄主植物带来广谱抗性。通过miRNA高通量测序及qPCR基因表达分析显示,在共生过程中,miRNA通过调控生长素相关基因及发育相关基因参与共生关系的建立。异位表达龙眼Fd3植株在接种印度梨型孢菌后显著改变了文心兰miR166、miR168、miR169与miR397及其靶基因PHV、AGO、NTF与LAC的表达水平,而转化龙眼FdCl植株呈现相反的表达趋势。综上所述,本试验通过同源克隆法与转录组挖掘技术相结合,分离了大量的龙眼R基因片段并获得13条的全长序列,进而对R基因在病原物侵染下及不同激素信号调控下的表达模式分析,发现植株可能通过整体调控R基因来响应病原物的侵染以获得SAR,其中miRNA所预测靶向的R基因在病原物侵染后呈现更为显著的上调表达;为进一步鉴定R基因的功能,从龙眼转录组中挖掘与拟南芥抗性相关激素信号标记基因具有一致性的序列并获得9条全长序列及1条5'末端序列,其中PR1-1、PR2-1、ERF1-2、VSP2-2、PDF1.2-1能特异性响应相关激素信号;进行了广谱抗性基因Fd基因在龙眼胚性培养物转录组的基因挖掘与克隆,共获得5条Fd全长基因序列,分别为叶绿体类非光合类型的Fd3、FdC1、FdC2以及线粒体类的MFDX基因,利用农杆菌介导法将龙眼Fd3、FdCl基因导入文心兰原球茎,通过一系列筛选培养获得再生植株,发现Fd3基因可以提高文心兰对抗软腐病的能力及移栽成活率,异位表达Fd3植株在接种印度梨型孢菌后显著改变了文心兰miRNA及其靶基因PHV、NTF、AGO及LAC的表达水平。本试验的研究结果将为进一步挖掘鉴定有效的龙眼抗性相关基因提供帮助,并为龙眼及其他物种的分子抗性育种提供科学依据。


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