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大黄鱼内脏抗氧化肽的制备、分离纯化及其理化性质研究

李致瑜  
【摘要】:本研究以大黄鱼内脏蛋白为原料,采用Alcalase蛋白酶可控酶解源蛋白制备抗氧化肽。通过超滤分离技术对不同分子量范围内的抗氧化肽进行分级分离,并筛选抗氧化活性最强的组分。采用H2O2诱导HepG2过氧化作为细胞模型,进而研究大黄鱼内脏抗氧化肽对细胞存活率和抗氧化防御系统的影响,同时研究了其对有ROS引导的炎症过程的抑制作用。另外,研究了大黄鱼内脏抗氧化肽的基本理化特性和抗氧化稳定性,为其在生产加工中的应用提供技术基础。在此基础上,进一步采用离子层析、凝胶层析、反相高效液相色谱及质谱测序技术对其进行分离、纯化和鉴定。首先分析了大黄鱼内脏的基本组成,以蛋白质的氨基酸组成评价其营养价值。脱脂后的大黄鱼鱼肉蛋白质干重含量为76.05%,水分含量15.68%,粗脂肪含量1.39%,灰分含量为4.54%。其氨基酸组成合理,必需氨基酸总量所占比例为46.61%,八种必需氨基酸含量都超过理想蛋白质模式;具有给质子能力的氨基酸占46.28%,其中芳香族氨基酸14.04%,疏水氨基酸占34.50%,是一种优质的制备抗氧化肽的蛋白质资源。通过Alcalase蛋白酶酶解大黄鱼内脏蛋白制备抗氧化肽,以酶解液的水解度(DH)、DPPH ·和羟自由基清除率为指标,比较不同酶添加量、pH值、温度、料液比以及酶解时间对酶解效果的影响,并用响应面法优化Alcalase蛋白酶酶解反应的工艺条件。结果表明:Alcalase蛋白酶酶解大黄鱼内脏蛋白的最优工艺条件为:酶解pH9.0、底物浓度8g/100mL、温度62℃、加酶量4.26%、酶解时间3.7 h,此条件下,蛋白质水解度为30.66%,DPPH·清除率为85.97%,羟自由基清除率为75.79%。依次采用截留分子量为10 kDa,5 kDa、3 kDa超滤膜对大黄鱼内脏抗氧化肽进行分级分离,获得四个不同分子量范围肽组分I(10kDa), II (5-10 kDa)、Ⅲ(3-5 kDa)和Ⅳ(3 kDa)。其中Ⅳ组分抗氧化活性最强,因此,采用Ⅳ进行后续实验。在不同的体外氧化实验体系中,大黄鱼内脏抗氧化肽均可有效发挥其抗氧化功能,采用H2O2处理HepG2,建立细胞过氧化模型,结果表明大黄鱼内脏抗氧化肽预处理可显著降低H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤,提高HepG2细胞存活率,同时细胞内抗氧化酶SOD、 CAT、 GSH-Px活性以及GSH水平显著提高。同时由可由ROS引导的炎症因子,具有一定的抑制炎症效果。研究不同条件和不同浓度下大黄鱼内脏抗氧化肽的理化和功能性质,包括溶解性、表观粘度、起泡性和乳化性。结果表明,大黄鱼内脏抗氧化肽中具有较好的溶解性和粘度,等电点为pH6。在等电点附近时,乳化性和泡沫稳定性随着pH的升高呈先下降后上升的趋势,即在等电点附近时,乳化性和泡沫稳定性降至最低,而乳化稳定性和起泡性则随着pH的升高呈先上升后下降的趋势,当pH为等电点时达到最大。随着多肽浓度的升高,乳化稳定性、泡沫稳定性有一定的提高,而乳化性有所下降,起泡性则没有显著变化。另外大黄鱼内脏抗氧化肽能有效抑制乳浊液的脂质过氧化。相对于传统乳化剂Tween 20,在150min后,10%的大黄鱼内脏抗氧化肽使MDA值降低了84.5%,并能显著抑制油滴的絮凝。研究NaCl、温度、pH值、紫外线辐射、糖、金属离子和模拟胃肠道消化对大黄鱼内脏抗氧化肽抗氧化稳定性的影响。结果表明:在中性pH、常温、低浓度NaCl以及适量K+,Ca2+,Al3+条件下,大黄鱼抗氧化肽抗氧化活性基本保持稳定,DPPH自由基清除率和Fe2+螯合力分别维持在88.5%和66.7%左右。在高浓度盐、高温、Fe2+, Fe3+, Cu2+等离子的引入和长时间紫外辐照下,大黄鱼抗氧化肽抗氧化活性下降超过30%。另外,酸性pH、70℃下加入葡萄糖、果糖、乳糖分别将大黄鱼抗氧化肽DPPH的清除活性提高至90%左右。相反,碱性条件有利于大黄鱼抗氧化肽螯合Fe2+活性,说明处理过程对不同抗氧化指标的影响有所差异。此外,胃蛋白酶消化处理对大黄鱼抗氧化肽抗氧化活性影响不显著,而进一步的糜蛋白酶消化却显著降低了多肽的抗氧化稳定性。分别采用离子交换层析、凝胶层析、半制备型反相高效液相等分离技术对超滤后的大黄鱼内脏抗氧化肽进行了分离纯化。结果表明:相对分子量较小且疏水性强的酸性组分表现出更强的抗氧化活性。纯化后,抗氧化活性最强的组分清除DPPH自由基的IC50值为0.72±0.017mg/mL。显著高于分离前的大黄鱼内脏肽,说明分离纯化可显著地富集抗氧化肽。


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