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花生RS基因根特异表达生产白藜芦醇的研究

马世伟  
【摘要】:白藜芦醇(Resveratrol,简称Res),是一种重要的植物抗毒素,存在于虎杖、葡萄、花生等植物中,在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。它具有多种生物活性,是一种天然的抗氧化剂,可以降低血脂,抑制血小板凝结,抗癌,抗炎,抗辐射,抗衰老,防治心血管疾病等。它与紫杉醇都被誉为绿色抗癌药物。但自然界中存在的白藜芦醇的含量较少,利用生物技术生产白藜芦醇有望高效生产白黎芦醇。白藜芦醇合酶(Resveratrol synthase,简称RS)是白藜芦醇合成的关键酶,本研究利用烟草的根特异表达启动子驱动花生白藜芦醇合酶基因在本生烟草和花生的发状根中表达,利用发状根的无激素依赖性和快速生长的特性,液体培养获得发状根,进而生产白藜芦醇。研究结果如下:1、用pBI121植物表达载体转化发根农杆菌,经由发根农杆菌介导转化本生烟草,发现发根农杆菌可以介导外源质粒载体携带的基因转入本生烟草基因组并在发状根表达,建立了发根农杆菌介导目的基因遗传转化本生烟草的成熟技术。通过该技术分别获得了发根农杆菌介异转化NtR12::RS和NtR2::RS融合基因的发状根转基因系,测定发状根系中白藜芦醇的含量最高为2.12 ug/g鲜重,是未转基因对照的4倍。说明发根农杆菌可介导自身的发根基因和外源基因在外源植物中表达。2、通过本生烟草发状根的液体培养研究,建立了发状根的液体培养体系,采用50mL液体MS培养基在28℃、120 r/min培养2周,可生产2.5 g发状根。研究NaAc诱导对本生烟草发状根液体培养体系中白藜芦醇产量的影响,结果显示,10 μM的NaAc处理能够有效提高培养基中白藜芦醇的含量,总产量提高1倍。3、为建立花生白黎芦醇生产体系,以新会小粒花生为材料,通过发根农杆菌探究了不同因素对花生发状根诱导的影响,发现河南发根农杆菌、菌悬液浓度(OD600)为0.5、共培养时间3d、花生幼叶外植体以及B5培养基有利于外植体转化和产生发状根;利用河南发根农杆菌介导35S::GUSA融合基因转入了花生幼叶,建立了花生发状根诱导的完整技术体系,并证明外源质粒载体携带的基因可以转入花生发状根表达。在此基础上把NtR12::RS和NtR2::RS导入花生,分别获得2和3个转基因系。经分析发现,转基因发状根系中白藜芦醇的含量最高达到了 80.99μg/g鲜重,为对照的5倍,说明根特异启动子NtR2和NtR12可以提高花生根RS表达,合成白黎芦醇。4、为进一步提高花生发状根的白黎芦醇生产效率,研究建立了花生发状根的液体高效培养体系,即1/2 MS培养基、28℃、120 r/min液体悬浮培养2周,50 mL培养基可生产2g发状根;NaAc诱导可增加发状根白黎芦醇含量,MeJA诱导不能增加发状根白藜芦醇产量,20 NaAc诱导处理花生发状根24 h,白藜芦醇产量可提高0.8倍(达141.03μg/g),并可促进白黎芦醇的分泌,而且使转基因发状根中白黎芦醇为野生型花生根的8倍。总之,本文首次研究利用特异启动子驱动花生白黎芦醇合酶基因在花生或异源植物发状根表达,建立了转基因发状根合成白黎芦醇生产技术体系。这为高效生产白黎芦醇奠定了基础。研究的深入有利于规模化生产利用白黎芦醇。


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