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大黄鱼鱼卵水溶蛋白抗氧化肽的制备及其活性研究

赵卉双  
【摘要】:大黄鱼鱼卵富含蛋白质、不饱和脂肪酸以及磷脂,具有极高的营养价值。目前只有少部分鱼卵被加工成食物、饲料等,大部分鱼卵均被当做废弃物处理掉,造成资源严重浪费。本文以大黄鱼脱脂鱼卵为原料提取其中水溶蛋白,通过酶解、分离纯化制备得到抗氧化肽,并对其进行结构鉴定和体外活性研究,为大黄鱼鱼卵功能食品的研发提供理论依据。(1)测定了大黄鱼脱脂鱼卵的主要成分,其中蛋白质、水分、脂肪、灰分的含量分别为:85.1%、8.3%、2.4%、4.0%。说明大黄鱼脱脂鱼卵是一种高蛋白、低脂肪的水产品。对水溶蛋白的提取条件进行优化,结果表明大黄鱼脱脂鱼卵水溶蛋白的提取量可达到33.56g/100g。对水溶蛋白氨基酸组成进行测定后发现,水溶蛋白中含有较多对抗氧化活性有较大贡献的氨基酸,如谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸等,因此其可作为一种制备活性肽的新型原料。(2)在合适条件下,采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶分别酶解大黄鱼脱脂鱼卵水溶蛋白。通过测定不同酶解物的多肽得率、DPPH自由基清除率,筛选出碱性蛋白酶作为制备多肽的试验用酶。通过响应面优化法得出当酶添加量为4000U/g,酶解时间1.5h,酶解温度45℃时,碱性蛋白酶酶解制备的多肽得率最高,可达430±15.6mg/g。(3)采用截留分子量为1OKDa、5KDa的超滤膜对酶解液PCPE进行分离,得到 PCPE1(10KDa)、PCPE2(5~1OKDa)、PCPE3(5KDa)三个组分。对各组分的抗氧化活性进行测定,发现PCPE3(5KDa)的抗氧化活性最好,其总抗氧化能力T-AOC的IC500值为10.179±0.055 mg/mL,清除 DPPH·,·OH,02·-自由基的 IC50 值分别达到 4.114±0.026、0.591±0.003、2.714±0.162mg/mL。(4)PCPE3组分经Sephadex G-15继续分离纯化,得到5个组分,依次命名PCPE3-1~PCPE3-5。对各组分的抗氧化活性进行测定,结果发现PCPE3-1抗氧化能力最强,其总抗氧化能力T-AOC的IC50值达到 4.214±0.067mg/mL,清除 DPPH·,·OH,02·-自由基的 IC50 值分别为 1.813±0.001、0.419±0.089、1.773±0.037mg/mL。(5)PCPE3-1组分经半制备反相高效液相色谱继续分离纯化,得到5个组分,依次命名PCPE3-1-1~PCPE3-1-5。对各组分抗氧化活性进行测定,结果发现PCPE3-1-1~PCPE3-1-4抗氧化能力较强,PCPE3-1-5抗氧化能力非常弱,不具备研究意义,因此对前四个组分进行序列分析。LC-MS/MS分析结果表明,其氨基酸序列依次为:Asn-Pro-Cys-Ala-Ser-Arg(NPCASR,645.99Da)、Gln-Glu-Ser-Glu-Glu-Tyr(QESEEY,782.99Da)‘Asn-Glu-Val-Gly-Ala(NEVGA,487.99Da)、Ala-Met-Cys-Cys(AMCC,425.99Da)。(6)通过建立由H_2O_2诱导的细胞氧化应激损伤模型,评价四条抗氧化肽的抗氧化能力。结果发现,这四种抗氧化肽对HepG-2细胞的氧化应激损伤均有保护作用,并可以通过提高细胞内抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活力以及GSH的含量,来降低ROS的含量,从而提高细胞的存活率。四种多肽的抗氧化能力为:NPCASRQESEEYNEVGAAMCC。活性最高的抗氧化肽 NPCASR可显著提高HO-1蛋白的表达量,近一步证实抗氧化肽具有良好的维持细胞内氧化还原正常水平及消除氧化应激造成的损伤的能力。


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