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白菜TCP基因家族的鉴定及利用CRISPR-Cas9系统进行编辑的初步探索

吴栋雄  
【摘要】:菜心(Brassica rapa L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)属于十字花科芸薹属芸薹种,是中国南方的特产蔬菜,在每日蔬菜供应中占有重要地位。菜心的叶作为主要的食用部位,叶型的好坏直接决定着菜心的品质和价值。在植物的叶和花发育等重要生命活动的进程中,TCP转录因子家族发挥着重要的作用,研究TCP基因家族的功能将为选育优良叶型的白菜新品种奠定基础。传统的育种方法存在着许多局限性,而CRISPR-Cas9定向基因编辑系统能对特定的DNA片段实现编辑、插入和敲除,是目前最高效和便捷的基因编辑技术。CRISPR-Cas9系统在白菜类作物中的应用报道较少。本研究通过生物信息学分析鉴定了白菜中的TCP转录因子基因家族,并进行白菜愈伤组织再生体系的优化和菜心CRISPR-Cas9遗传转化体系的初步探索,为白菜CRISPR-Cas9基因编辑系统的建立奠定基础。得到如下实验结果:1、白菜TCP转录因子基因家族的鉴定。通过BRAD网站获取白菜TCP基因家族所有39个成员的CDS序列。通过BRAD和Phytozome分别整理白菜和拟南芥基因组中TCP家族的氨基酸序列,利用neighbor-Joining方式构建系统进化树比较它们之间的同源性。利用可视化软件Circos将上述基因定位于白菜和拟南芥基因组对应的染色体上,并预测这些基因在这两个物种染色体上的共线性。用在线定量引物设计软件Quantprime设计白菜TCP基因家族半定量检测的引物。提取白菜3周大植株的根、茎顶端分生组织I期、茎顶端分生组织II期、茎顶端分生组织III期、子叶、第一片真叶、第二片真叶、下胚轴和叶柄的总RNA,逆转录为cDNA,通过半定量PCR检测白菜中TCP基因家族39个成员的转录水平。发现这些TCP基因中有25个存在明显的表达,总体上在第二片真叶和叶柄中的表达水平较高,有8个基因在各个组织中都有表达,而其他17个基因都表现出了不同部位的表达特异性,表明这些TCP极有可能在白菜叶的形成过程中起着非常重要的调控作用。2、菜心不定芽诱导和再生系统的建立以及菜心遗传转化系统的初步探索。以菜心种子为材料,通过对菜心高效不定芽诱导体系中影响外植体分化不定芽的各个因素进行探索,包括6-BA和NAA不同浓度的组合、gelzan浓度、AgN03浓度等因素的探索,构建菜心不定芽诱导和再生体系,确定菜心最佳不定芽诱导培养基为4.43 g/L MS 粉末(M519)+2 mg/L 6-BA+0.45 mg/LNAA+4 mg/L AgNO3+20 g/L蔗糖+3 g/L gelzan(pH值为5.8)。利用农杆菌介导法初步探索以菜心带子叶柄-子叶为外植体的基因编辑转化系统。通过对菜心潮霉素敏感性、抑菌剂的种类及浓度、恢复培养等因素的摸索,初步探索适用于菜心的遗传转化体系,确定菜心遗传转化体系中,潮霉素最佳筛选浓度为6mg/L,最佳的抑菌剂为200mg/L羧苄青霉素(Carbenicillin)。共培养后直接进行分化培养,发现外植体很难产生愈伤组织和不定芽,而在共培养后对外植体进行4 d的恢复培养后再进行分化培养,成功获得了愈伤组织但仍然没能获得抗性再生芽。推测无法获得阳性苗的原因可能是筛选剂潮霉素抑制了愈伤的再生,或者是由于农杆菌GV3101不易转化菜心,下一步拟通过对质粒进行抗性替换或构建LBA4404农杆菌载体,希望能够成功实现转化和编辑。3、根据前人的研究和本研究中对于TCP基因家族的鉴定结果,选定白菜TCP14作为基因编辑的靶点。以通过CRISPR/Cas9在线引导RNA设计网站设计白菜TCP14基因的sgRNA,构建对TCP14进行基因编辑的载体pCBIM-Cas9-TCP14-sgRNA1和pCBIM-Cas9-TCP14-sgRNA2。利用菜心再生系统以及遗传转化系统对白菜CRISPR/Cas9基因编辑系统进行初步探索。总之,本研究通过对白菜TCP转录因子基因家族进行分析鉴定,并且分别进行白菜不定芽再生体系的优化和农杆菌介导的菜心遗传转化体系的初步探索,为CRISPR-Cas9基因编辑系统的建立和研究菜心中TCP转录因子家族的功能以及获得菜心叶型新种质奠定基础。


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