番鸭肠道乳酸菌筛选鉴定、抑菌作用及对Caco-2细胞粘附的影响

【摘要】：本研究从成年番鸭肠道分离筛选出抗病原微生物的乳酸菌6株,采用16S r DNA基因分子技术进行菌种鉴定,并通过体外分析法对筛选的乳酸菌进行益生效果评价,同时研究分离的菌株对Caco-2细胞粘附效率和黏附因子的影响,为更好地利用乳酸菌微生态制剂提供实验基础。研究包括以下两个方面的主要内容:1、番鸭肠道乳酸菌的分离鉴定试验选用番鸭(平均体重为3.5 kg,300 d)30只,解剖并分离培养其肠道菌群。进行如下试验:1)MRS固体培养基分离筛选并纯化乳酸菌;2)形态学观察分离纯化的乳酸菌;3)乳酸菌特异核酸序列的测序比对。结果:1)分离的菌株中既有球菌属也有杆菌属;2)分离的6株乳酸菌与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、哥伦比亚肠球菌(Enterococcus columbae)、鼠乳杆菌(L.murinus)高度同源。结果提示:分离的6株乳酸菌革兰氏染色均为阳性,分别命名为CM1、CM2、CM3、CM4、CM5和 CM6。产酸性能试验结果显示,6株乳酸菌产酸性能良好,终pH为3.85、3.51、3.67、3.39、3.37和3.35。对酸度、胆盐、消化酶的耐受试验结果显示,菌株对高浓度的酸及胆盐有一定的耐受性,在消化酶存在的条件下也能够有相对高的存活率。抗生素敏感性试验结果显示,6株乳酸菌对青霉素、红霉素敏感,对氧氟沙星、呋喃妥因及复方新诺明存在耐药性。2、乳酸菌益生性能的研究对筛选出的6株乳酸菌进行如下试验:1)牛津杯法检测乳酸菌的抑菌作用;2)SEM法检测乳酸菌对Caco-2细胞的粘附作用;3)RT-PCR法检测乳酸菌对Caco-2细胞相关黏附因子的mRNA表达水平。结果:1)6株乳酸菌对肠道常见细菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有一定的抑菌效果。对大肠杆菌的抑菌效果差异不显著(P0.05);对沙门氏菌,菌株CM3显示了较强的抑菌活性,抑菌圈直径为19.41 mm左右;对金黄色葡萄球菌,菌株CM6的抑菌活性要远高于其它5株乳酸产生菌,抑菌圈直径为17.26 mm左右;2)6株乳酸菌对Caco-2细胞均具有一定的粘附能力,进一步对细胞的粘附特性包括疏水性和自凝集能力等进行研究发现,经正十六烷处理后,菌株CM3和CM4与其结合率最高,分别为99.79%和99.72%,其中菌株CM3的自凝集能力明显高于其它菌株,为90.16%;3)RT-PCR检测发现,与空白对照组相比,菌株CM3处理的试验组中,F-actin基因的mRNA表达水平极显著提高(P0.001),在沙门氏菌处理组和沙门氏菌及菌株CM3共同作用处理组中,F-actin基因的mRNA表达水平均显著提高(P0.05);在沙门氏菌处理组和沙门氏菌及菌株CM3共同作用处理组,CaM和E-cad基因的mRNA表达水平均显著下降(P0.05);与菌株CM3处理组相比,沙门氏菌处理组和沙门氏菌及菌株CM3共同作用处理组的CaM、E-cad和F-actin基因的mRNA表达水平均极显著下降(P0.01)。结果提示:菌株CM3对3株指示菌的抑菌圈直径最大,抑菌效果最好,且杆菌属菌株CM1,CM3及CM6对Caco-2细胞的粘附效果和球菌属菌株CM2,CM4及CM5的相比,存在显著差异(P0.05),疏水性研究显示,番鸭肠道分离出的这6株乳酸菌细胞表面均呈酸性,菌株CM3和CM4疏水性最强,其中菌株CM3的自凝集能力最高。综上所述,在对番鸭肠道分离的乳酸菌生长特性、产酸性能、耐受性、抑菌效果及对Caco-2细胞的粘附能力进行比较后,筛选出了 1株(CM3)优良的番鸭源乳酸菌菌株,可作为益生素应用于动物临床实验,并有望推广于动物生产。