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Vip3AcAa对几种鳞翅目害虫的毒杀机制及与Cry1Ac的交互作用

陈文波  
【摘要】:自1997年以来,我国开始广泛种植转基因Bt棉花,Bt棉的种植在有效防控棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)的同时,提高了棉花产量,减少了化学杀虫剂的使用量。但棉铃虫对Bt棉的抗性进化仍是对我国棉花生产中的一项挑战。另外对Cry1Ac具有耐性的棉花上的鳞翅目次要害虫对棉花为害逐年加重,且有上升为主要害虫的趋势。为研发新一代转基因抗虫棉,以延缓害虫抗性进化及扩大转基因棉花杀虫谱,前期利用重叠法合成了融合蛋白Vip3AcAa(由Vip3Ac1 N端600个氨基酸残基和Vip3Aa1 C端189个氨基酸残基构成)。此融合蛋白对欧洲玉米螟Ostrinianubilalis产生了杀虫活性,对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda具有高的杀虫活性并且对Cry1Ac抗性粉纹夜蛾Trichoplusia ni同样具有高杀虫活性。在本文中利用透射电镜和HE染色荧光镜观察了 Vip3AcAa蛋白对靶标害虫中肠组织的损伤病理特征;分析了靶标害虫中肠提取液对Vip3AcAa原杀虫蛋白的水解;测定了 Vip3AcAa 在棉铃虫 H.armigera、斜纹夜蛾Spodoptera litura、甜菜夜蛾Spodoptera exigua和小地老虎Agrots ipsilon中肠BBMV上的特异性结合位点;测定了 Vip3AcAa蛋白对棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和小地老虎的杀虫活性;分析了 Vip3AcAa蛋白与Cry1Ac蛋白间的交互抗性及交互作用;另外在室内对转Vip3AcAa+Cry 1 Ac双价棉的抗虫性进行了测定。主要结果如下:1.透射电镜和He染色荧光镜观察发现Vip3AcAa蛋白对靶标害虫棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和小地老虎中肠的损伤特征主要表现为中肠底膜与柱状细胞脱离,柱状细胞细胞质大量空泡化,杯状细胞不规则且被拉长,顶端微绒毛大量脱落。2.靶标害虫棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和小地老虎中肠提取液都能够将Vip3AcAa原杀虫蛋白水解为约70 kDa大小的核心多肽片段;胰蛋白酶活性降低或ABCC2基因突变介导的Cry1Ac抗性棉铃虫幼虫中肠液与敏感棉铃虫幼虫中肠液对Vip3AcAa原杀虫蛋白水解速率相比并无显著性差异;不同物种间幼虫中肠消化液对Vip3AcAa原杀虫蛋白的水解速率有差异性。3.通过同源及异源竞争结合试验表明Vip3AcAa与Cry1Ac蛋白在棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和小地老虎幼虫中肠BBMV上无共同结合位点;通过配体免疫印迹方法确定Vip3AcAa蛋白能够结合棉铃虫BBMV上40、80和100 kDa的蛋白分子,斜纹夜蛾BBMV上36、39、68和100 kDa的蛋白分子;甜菜夜蛾BBMV上34和100 kDa的蛋白分子,小地老虎BBMV上35、55和110 kDa的蛋白分子,表明Vip3AcAa在此四类靶标害虫体内可能存在相同分子大小的受体,且它们可能是相同类型的Vip3AcAa的结合受体。4.Cry1Ac抗性棉铃虫与敏感棉铃虫对Vip3AcAa蛋白的敏感度无显著性差异,即Vip3AcAa融合蛋白与Cry1Ac杀虫蛋白间不存在交互抗性;Vip3AcAa与Cry1Ac混合使用防治棉铃虫时具有叠加效果,并没有出现明显的拮抗作用;另外生物测定结果表明Vip3AcAa对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和小地老虎(此三类鳞翅目昆虫对Cry1Ac蛋白不敏感)具有很高的杀虫活性。5.转基因棉抗虫性测定结果表明转Vip3AcAa+Cry1Ac双价棉对敏感棉铃虫和Cry1Ac抗性棉铃虫初孵幼虫都具有良好的防控效果;尽管此转基因棉花相对于斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和小地老虎是单价转基因棉,但是在室内抗虫测定中依然表现出了高效的抗虫能力。Vip3AcAa是人工合成的一种新型杀虫蛋白,其对棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和小地老虎都具有良好的杀虫活性,并且Vip3AcAa蛋白与Cry1Ac蛋白间不存在交互抗性,两者共用时具有叠加效应。转Vip3AcAa+Cry1Ac双价棉在室内抗性测定中表现出了优良抗虫性。以上结果表明Vip3AcAa基因可以作为一个候选基因用于新一代转基因Bt棉育种,用于延缓害虫抗性进化及防治对Cry1A杀虫蛋白不敏感的鳞翅目害虫,进一步补充和完善当前我国害虫综合防治策略。


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