禽流感病毒(H5N1)基因(h5n1a)在马铃薯中的转化与表达研究——附：乙肝表面抗原(HBsAg)基因转化的对比研究

【摘要】： 本研究首次将禽流感病毒（H_5N_1）基因h5n1a导入马铃薯获得 表达，并优化了转化系统，为商品化生产转基因植物疫苗提供科 学依据。 1、为了优化马铃薯（Solanum tuberosum L.）以块茎为受体 的再生系统。着重对诱导分化和结薯培养基作了较系统的筛选。 以MS为基本培养基，调整激素配比，得到M1、M2、M3、M4等4 种培养基。比较试验结果以M4（MS＋2.0mg／L BA＋3.0mg／L ZT＋0.5mg／L NAA＋0.5mg／L GA_3）诱导块茎分化的效果最佳，丛芽分化频率达89.4％， 分化时间提早约20天。同时筛选了诱导结薯的较优培养方法，获 得使试管薯结薯数增加近1倍的壮苗和诱导结薯培养基组合（壮 苗：1／2MS＋0.5mg／L BA＋0.5mg／L GA_3＋3％Suc；诱导结薯：MS＋2.0mg／L BA＋3.0mg／L ZT＋10％Suc），为获得高频转化奠定了基础。 2、构建了4个植物表达双元载体。p1301BG含有增强型绿色 莹光蛋白基因egfp；p1301BΩG在egfp与35s启动子之间插入65bp 的增强子序列Ω因子；p1301H5N1含有禽流感病毒基因h5n1a； p1301HBs含有乙肝表面抗原基因HBsAg。这4个载体均以35s为 真核表达启动子，报告基因和目的基因以Tnos为终止子、植物筛 选标记基因以35s PolyA加尾，融合成嵌合基因。原核抗性为Kan。 分别用直接法导入农杆菌EHA105、LBA4404和AGL1。 3、初步比较了ZHFQ-2型火药式基因枪与农杆菌的转化效果， 发现，该基因枪微弹分散性差，转化结果不稳定，对受体材料损 伤较大，未能筛选到转化株；而农杆菌转化相对较稳定，并初步 发现外源基因的瞬时表达大多集中在受伤和形成层部位。 4、对农杆菌转化条件的比较研究发现，菌株、菌体状态、稀 中文摘要 释度以及真空、激素和AS处理，均对转化有很大影响。对3个菌 株（LBA4404、EHA105和AGLI）的侵染性比较发现，用EHA105转化 马铃薯块茎，GUS瞬时表达效果更好；比较几种转化条件下的GUS 瞬时表达结果，筛选到可获得高且稳定的GUS瞬时表达的转化条 件：菌体用 Mg（MS＋0．sing／L GA3＋10umol／L AS）液体培养基稀释 4倍，与受体于28oC、100rpm振荡侵染20－30min，共培养时在分 化培养基上加 30卜 mol／L AS（乙酚丁香酮），16hr弱光照共培养 3d， 使GUS瞬时表达活性提高了3．4倍。 5、在进行抗生素基础抗性测定和转化体筛选时，比较马铃薯块茎 对Hgg和Kan两种筛选剂的敏感性，发现马铃薯块茎受体对Hnn更 敏感，因此选用Hgg为抗性筛选剂。在此基础上改进了筛选策略， 提出间段压力筛选法。该方法与常规的连续压力筛选法相比，大 大减低了基础抗性确定的主观性对转化效率的影响。使获得抗性 株的频率提高了82儿外源基因阳性率提高了2．4倍，获得转化株 的时间提早7－10天。 6、获得 HSNI转基因马铃薯株系 31个，并对其外源基因的整 合和表达做了系统检测。GUS表达活性结果表明，外源基因己插入 马铃薯基因组并得到表达，但株系间差异较大，说明外源基因整 合的随机性。用hsnla双引物扩增马铃薯基因组总DNA，得到与 目的基因大小一致的特异性片段。以DIG标记的hsnla探针进行 Southern杂交，进一步证实基因hsnla已整合到马铃薯基因组中， 且初步确定为单拷贝插入。 7、用HSNI 鼠单抗与马铃薯块茎蛋白粗提液进行抗原抗体反 应证实，在马铃薯中表达的外源基因具有抗原抗体反应活性，这 是禽流感病毒（HSNI）基因首次在植物中的表达。由于禽流感病 2 禽流感病毒（HSNI）基因（hjnla）在马铃薯中的转化与表达研究 毒m）是新病毒株，最近才得到其鼠的单克隆抗体，还末能 进行定量检测，以及动物免疫实验结果检测。 8、为了证实所建立的转化系统的有效性，本研究同时进行了 乙肝表面抗原＊BSAg）基因在马铃薯中的表达研究，并对结果做 了详细报道。在马铃薯中表达的乙肝表面抗原，经乙肝抗原检测 试剂合检测，具有较强的抗体结合活性，且初步测定表达的抗原 蛋白最高占马铃薯可溶性总蛋白的0．34“ 9、本试验虽然获得了预期结果，但对转基因马铃薯作为疫苗 的动物试验，以及遗传稳定性等试验等尚需时日，无法进行。虽 然我们同时进行了乙肝表面抗原基因HbsAg－s的转化试验，以检 验所设计的技术路线的有效性。但为了实现商品化的植物疫苗生 产目的，尚需进一步研究解决取材、方法、转化、筛选和检测等 一系