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烟草花叶病毒弱毒疫苗的研制及其分子生物学

邵碧英  
【摘要】: 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是烟草花叶病毒属 (Tobamovirus)的代表种,给许多种植物造成严重损失。福建农林大学植物病 毒研究所对福建烟草病毒种群和田间发生频率的调查研究表明,TMV在福 建几个主要烟区占有很高的比例,其中以TMV普通株系为优势株系。利用 病毒的弱毒株的交互保护作用是防治病毒病较为理想的手段之一。为此本文 对TMV弱毒株的获得方法、生物学特性、分子生物学方面进行了较系统的 研究。 从福建烟区分离、纯化、鉴定到TMV普通株系。通过高温处理、亚硝 酸诱变及两者的复合处理对强毒株TMV-W进行诱变,筛选获得了两个弱毒 株,记为TMV-017(高温处理)、TMV-152(复合处理)。应用正交设计法考察 病毒接种浓度、接种间隔时间、接种部位以及普通烟生育期等因素对弱毒株 交互保护作用的影响,结果表明烟苗生育期和接种间隔时间两个因素影响最 大。弱毒株接种12d后才有较好的保护作用。浸根法可适用于弱毒株的大量 接种。 考察了弱毒株本身对烟草植株的影响。在普通烟上分别接种TMV-W、 TMV-017、TMV-152,考察3者在接种叶上的病毒的增殖情况以及叶绿素a、 叶绿素b、叶绿素、可溶性蛋白含量的变化。结果表明弱毒株的增殖速率、 在烟草植株体内的稳定浓度低于强毒株。分别受强、弱毒株侵染的烟草叶片 中的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素含量均有所下降,但强毒株引起的下降幅 度最大。可溶性蛋白含量变化幅度不太明显。 观察了分别受TMV-W、TMV-017侵染的烟叶细胞病理的变化。健康烟 叶的叶绿体具双层膜,基粒片层紧密整齐,内含大量淀粉粒。受TMV-017 侵染的烟草细胞中,叶绿体数量较少,叶绿体具双层膜结构,基粒片层排列 整齐,有的叶绿体膨大,内含少量小的淀粉粒。叶绿体周围经常出现4-6个 线粒体。细胞质中出现结晶状内含体,经常存在于叶绿体周围。受TMV-W 浸染的烟草细胞中,有的叶绿体破裂,基粒松散。细胞质中的线粒体增多, 增大,有的形状不规则。细胞质中也出现晶体状内含体,分布在叶绿体周围。 测定了TMV-W、TMV-017、TMV-152的基因组cDNA全序列(GenBank 福建农林大学博士学位论文 * 接收号分别为:AF395127、AF395128、AF395129X 结果表明,强、弱毒株 基因组均为 6395个核昔酸,具有 4个开放阅读框(ORF),分别编码 126kDa 蛋白(69-3419nt,ill6ed和183kDa 通读蛋白(69-4919nt,1616eq、运动蛋白 (4903-5709m,268盼)、外壳蛋白(5712-619Im,159eq。5’端非编码区爬) 为68nt*,通读蛋白和运动蛋白基因有17个碱基重叠,运动蛋白和外 壳蛋白基因间隔区为Znt(5710-57lint),3’端NR区为204nt(6192-6395nt)。 TMV-W和TMV-UI相比,基因组同源率达到98%,TMV.W为普通株系。 TMV,of 7、TMV.152基因组核苦酸发生变异的部位主要在126/183kDa蛋白 ORF。和 TMV.W相比,TMV.of 7仅在 126kDa蛋白 ORF中有 18个碱基发 生变异,m个引起氨基酸的变异;而TMVJ 在126门83kD蛋白OM中 有 16个碱基发生变异,其中有 11个引起氨基酸的变异。TMV.of 7和 TMV. 152有 11个共同变异的碱基,其中 8个引起氨基酸的变异。TMV-152在 MP Ony中有1个碱基引起氨基酸的变异。其它区域,三者完全相同。 首次尝试将弱毒株的缺失复制酶基因转化烟草。构建了含TMV.W、 TMV-of 7各2个126kDa 蛋白O肚的部分片段,EIEZ(873-2813nt)、 RI EZ的928 3nt)的植物表达载体。经农杆菌 Ti质粒介导转化烟草。再生植 株总DNA的Southern点杂交检测结果初步表明,一个片段均己整合到烟草 基因组中。再生植株总RNA的RT-PCR Southern点杂交检测结果初步表明, 4个片段均有转录。用含TMV-W EIEZ的重组克隆和载体pGEX上,构建 了重组原核表达载体,诱导表达出融合蛋白O4kDal,制备了抗血清。免疫 斑点杂交检测抗血清的适宜工作浓度为 1:100。转化植株能延迟、减轻攻 击病毒oMV-W)的症状表现,含 TMV-W EI EZ片段的转化植株中有 1株抗 性水平高。


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