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甘薯抗线虫病基因的分子检测

郭金平  
【摘要】: 本研究以11个经线虫病常规鉴定的甘薯品种(6个高抗,2个抗病,3个感 病)和11个未经线虫病常规鉴定的甘薯品种为供试材料,首先对CTMB法和 SDS法提取甘薯基因组DNA进行了方法探讨,然后根据甜菜抗线虫病基因 的保守序列区域,设计了三条上游引物,三条下游引物,共产生了9组组合,进 行了PCR特异扩增,从中筛选出一对特异引物,并优化了PCR扩增的反应体 系中的各个影响因素,通过特异扩增最终获得了一条630bp大小的特异片 段,并进一步做了PCR-Southern杂交,以确认该特异片段的同源性程度和真 实性,最后对11个未经线虫病常规鉴定的甘薯品种进行了初步的检测,所得 结果如下: 1.建立了适合于甘薯的PCR特异扩增的反应体系:20μl反应体系中, 含10mmol/L Tris-HCI(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl_2,100μ mol/L dNTP,0.3μ mol/L特异引物,50ng模板DNA,1.0U Taq DNA聚合酶; 反应程序为:94℃,5min,1 cycle;94℃,40s,58℃,50s,72℃,90s,35 cycles;72℃ 延伸10min。 2.通过对CTAB法和SDS法提取甘薯的基因组DNA的比较,结果表 明CTAB法比较适合提取甘薯基因组DNA。 3.对11个经线虫病常规鉴定的甘薯品种的PCR检测结果与线虫病常 规鉴定基本一致,吻合度达10/11,表明PCR检测是可行的。 4.对特异PCR产物进行了PCR-Southem杂交,结果显示它们有杂交信 号,说明该片段与甜菜抗线虫病基因有较高的同源性,为克隆甘薯抗线虫病 基因奠定了基础。 5.11个未经线虫病常规鉴定的甘薯品种中,8个出现抗线虫病基因的 特异条带,3个未出现任何条带,此结果需进一步做田间常规鉴定来验证。


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