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果树单染色体及其R基因同源序列的分离与克隆

黄代青  
【摘要】: 果树是一类经济价值很高的园艺作物,然而由于其自身的一些特点,使其遗传研究难度很大,基因组研究更是处于落后状态。我国是多种重要果树的起源中心,拥有十分丰富的果树种质资源,而在果树基因组研究方面却刚刚起步。为此,本研究选择一些具有我国特色的果树种,拟将近年来发展起来的染色体微分离微克隆和同源序列扩增两项新技术引入果树基因组研究,探讨它们在果树的基因组研究中的可行性和应用价值。 本研究选用典型小染色体的现代果树种柚和相对大染色体的古老果树种银杏为材料,从染色体标本的制备、微细玻璃针的制作、单染色体的显微分离等方面进行了探索,建立了一套有效的木本果树染色体显微分离技术体系。在此基础上,对分离的单染色体DNA进行了体外扩增,并对扩增产物进行克隆,构建了单染色体DNA的质粒文库。根据已知植物抗病(R)基因的保守结构域设计特异简并引物,从柚和银杏的基因组DNA以及柚的花柱cDNA中对R基因同源序列(RGA)进行扩增和克隆,在此基础上,结合染色体显微分离技术,从单条染色体DNA及其扩增产物中分离RGA获得成功。主要结果和结论如下: 1 果树单染色体显微分离技术研究 1)以幼胚为材料,不经前处理和固定,直接低渗、酶解和压片,可获得众多分散良好的柚前中期和中期细胞分裂相。 2)冰水离体处理根尖28h,结合酶解、低渗和压片,可获得染色体适度缩短、分散良好的银杏中期分裂相。 3)建立了一套拉针仪和自制的微火酒精灯相结合的半自动玻璃针制备系统,大大提高了制针效率。 4)借助显微操作系统,采用粘取法和挖取法,成功地分离出柚和银杏的单染色体,表明在具有良好的染色体标本和合适的玻璃针基础上,果树的染色体不论大小均能被成功地分离。 5)多数染色体在显微镜下无法区分,要识别和分离特定的染色体难度极大。特别是小型染色体,必须对照核型图,并对染色体标本做好定位标记。按照此法,本研究成功地识别并分离了柚的第一染色体及银杏的W和11号染色体。 2.单染色体DNA的体外扩增与克隆 1)用LA-PCR和DOP-PCR两种方法成功地对柚的单条染色体进行了体外扩增,分别获得了片段大小为300~2000bp和150~600bp的柚单染色体DNA库(pool)。结果显示LA-PCR方法获得的扩增片段较大,且污染控制相对容易。 2)用 LAPCR isdg-r---杏的 W染色体和 11号染色体进行了有效的体夕+扩增,获 得了片段大小分别为30小3000bp和30饲500bp的W染躺0 11号染色体DNA库。 3)用 pGEMT Ep VeCtr克隆 PCR产物,构建了抽单染色椭D银杏 W Wb体 的DNA质粒文库,分别得到26000和 75000个重组子。随机分析部分重组子,发现 两个文库的插入片段大小主要在500~1500hp之间,平均为850hp。 3单染色体NBS-LRR类R基因同源序列(RGA)的克隆与分析 1)利用R基因的特异简并5;物PI/PZ N基因组DNA中扩增、克隆获得2个 RGA,并进一步从袖的花柱dD:N-x中获得10个RGA。说明引物PI/PZ y增抽RGA 的有效性。 2)湘的同一分驯中删分离了6条染酣,分别置于6个即pendof管中, 6管分别编号为1,2,3,4,5,6。其中的l、二两管单蛆晰构建为单染色体 DNA库,然后取其中的一部分作为模板用Plnd jlf;r7-同源扩增(方法1);另4管(3、 4、5、6)单染色体分别在去蛋白后直接作为模板,用引物PI/PZ进行2轮的同源序 列扩增(方法U。两种方涪分别有 l剁叮条染色体获得了 500bpZf;F的扩增带。 3)对2和6两管单染色体的扩增带进行回收牙克隆,然后对阳性克隆酶切归类, 发现2号管染色体(方法1)的阳性克隆的酶切图谱多态性较差,只归成8类,而6 ; 号管染色体(方法二)的克隆可归成30多个不同的类别。 4)两条染色体各选5类克隆进行测序,同源比较分析发现,10个片段均为RGA。 聚类分析显示,来自2号管(方法1)单染色体的SM列聚成单独的一类,很可能 是属干同一基因簇;而6号管单染色体(方法2)的SM列则差异较大,分别与 几个己知R基因聚在一起。由此推狈uZ管染色体上抗病基因分布得少,6号管染色 体则有较多的抗病基因簇分布。同时,由于方法2简便而有效,因此更值得推广。 5)本研究中获得的RGA可进一步用于袖抗病候选基因的筛选,亦可作为单染 色体的分子标记,用于染色体遗传图谱的构建。因此本研究为果树R基因的研究与 克隆乃至果树的基因组研究提供了一条崭新的思路,并建立了一套可靠的技术体系。


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