乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、戊肝病毒ORF2基因片段NE_2在番茄中的表达及免疫活性

【摘要】： 本研究以番茄子叶和下胚轴为材料，以Gus瞬时表达效率为指标，系统研究了农杆菌介导的番茄遗传转化的影响因素，在此基础上建立并优化了番茄“羞女”品种的遗传转化体系；构建乙型肝炎病毒表面抗原基因(HBsAg)、戊型肝炎病毒ORF_2基因片段NE_2(HEV-NE_2)的植物表达载体，利用已建立的转化体系将其导入番茄，获得了经PCR和Southern杂交证实的转基因植株。ELISA检测结果显示在番茄中表达的目的蛋白具有较好的免疫活性；动物试验结果初步表明，用转基因番茄表达的HBsAg口服或肌注初免过的小鼠，均有不同程度的加强免疫效果。展示了用番茄研制乙肝、戊肝口服疫苗的美好前景，为推动转基因植物口服疫苗走向实用化提供实验基础和理论指导。 1．植物表达载体构建：利用含GUS和去GUS的中间载体pCAMBIA1301和pCAMBIA1300构建了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、戊肝病毒ORF_2基因片段NE_2的植物表达载体p1301HBs、p1300HBs、p1301NE_2和p1300NE_2。其中含CaMV35s启动子、nos终止子、Ω增强子、Kan抗性筛选标记Kan~r和潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)。经酶切鉴定后直接法导入农杆菌菌株LBA4404、EHA105、AGL1。 2．农杆菌介导的番茄遗传转化体系的建立和优化：以含质粒p1301HBs(含Gus基因)的根癌农杆菌侵染番茄外植体，以Gus瞬时表达效率为指标，系统研究了农杆菌菌株、外植体年龄、预培养时间、共培养时间、培养条件、筛选条件等对转化效率的影响并在此基础上建立、优化了番茄“羞女”品种的遗传转化体系。 福建农林大学博士学位论文 中文摘要 即：EHA 105菌株；外植体苗龄gd暗光下预培养3d，或苗龄12d 暗光下预培养Zd：农杆菌侵染后暗光下共培养3小筛选剂潮霉素 （Hrr）浓度为20mm／L，杀菌剂前期用梭芋青霉素（Carb），后期 用头抱霉素（Cef），浓度初期 500mg／L，以后逐渐降低。 将该体系运用于去 GUS标记的 PI 300HBS和戊肝病毒基因的 转化，得到了较好的结果，说明该体系是可靠、可重复、有效的。 3．转基因苗的鉴定及目的蛋白的定量：抗性苗总DNA经 PCR、Southern杂交证实目的基因己整合到番茄基因组中，ELISA 检测结果证明在番茄中正确表达了具有免疫活性的乙肝病毒表面 抗原蛋白门BSAg人戊肝病毒ORFZ基因片段NEZ（HEV－NEZ人 根据ELISA定量结果，HBSAg在番茄中最大表达量约为240刁00 us／s，约占总可溶性蛋白的0．003％，而eV－NEZ的表达量较低。 目前己扩繁转HBSAg的转基因苗40多株，已结番茄100多个，保 存有转HEV十 的转基因苗7株，其中有一株己结两个果实。 4．小鼠免疫试验：以0．sllg／g亚免疫剂量初兔的小鼠，4 周后用转HBSAg的转基因组织饲喂，至第8周抗体由饲喂前的 0．4上升到互．0以上；用浓缩、纯化过的植物蛋白加强免疫初免 过的小鼠，也发现有较强的特异性抗体上升。说明用番茄表达的 重组HBSAg具有免疫原性。