花生微卫星DNA的分离与多态性研究

【摘要】： 花生是一种重要的经济作物和油料作物，尽管其农艺性状存在着广泛的遗传变异，但在DNA分子水平上的差异却十分有限。微卫星DNA或简单重复序列(SSR)是近年来发展的一种新的DNA分子标记，由于这种标记在基因组内含量丰富且变异水平高，从而被用来作为建立分子图谱的标准标记技术之一。微卫星DNA的分离有多种方法，其中传统的方法是用放射性标记的SSR探针筛选基因组文库，这种方法所需时间长、工作强度大、消耗多、效率低，不宜用来从含量并不丰富的植物基因组中分离微卫星DNA，同时当需要获得大量的SSR标记来建立遗传图谱时，这一方法也不适用。 本研究先将基因组DNA转化成选择性扩增的DNA片段(AFLP)，然后用生物素标记的SSR作探针与其杂交，杂交后的片段与包被在磁珠表面的链亲和素(streptavidin)结合，经过一系列的洗涤过程后，不含SSR的部分被洗掉，而含有SSR的AFLP片段被大量富集。研究中采用了两种富集方法，第一种方法是所用的DNA片段是经过具有三个选择性核苷酸引物扩增的AFLP，富集后的产物经过扩增后在聚丙烯酰胺胶上呈现清晰的条带，将这些专一性条带中的DNA提取后扩增、纯化，直接用于测序。总共用10个SSR探针对从235对AFLP引物扩增的DNA片段进行了富集，并获得了155条专一性条带，对其中121个片段进行了序列分析，得到9个含有微卫星DNA的序列。根据序列结构，设计了9对引物，其中7对引物扩增成功。所有引物在22个花生品种中均未能检测出多态性。但是，通过改变扩增条件，其中的一对引物，即Pm-8的扩增产物中，有两个来字墨西哥的品种，即PI576613和PI576617，缺乏一条专一条带。Pm-8的扩增产物并不是典型的微卫星DNA类型，而是一个序列标签位点(STS)，这一标记在辨别品种方面可能会有一定的作用。 在第二种方法中，用于富集SSR的DNA片段是经过一个选择性核苷酸AFLP引物扩增产物。实验公选用5个SSR探针，即(GA)_(15)，(GT)_(15)．(AT)_(15)，(GGC)_(10)，(ATT)_(10)．所采用的AFLP引物是HindⅢ-A／MseI-N，Mse-N，(N代表四种核苷酸中的一种)。AFLP片 段经过磁珠筛选富集后，洗脱下来的含有SSR的片段克隆到质粒中。插入的片段在细菌 中经繁殖后用T3／T7引物扩增，用琼脂糖凝胶分离，经纯化后用于测序。共对208个克隆 进行了序列分析，在排除了序列相同的克隆后，共得到了14个克隆含有微卫星序列，据 此设计了14对引物，用以扩增44个栽培花生的基因组DNA。在14对引物中，Pm－15检 测到4个等位基因。其他23对引物（含用第一中方法获得的引物）均未能扩增出多态性 产物。结果还表明，花生基因组中GA／CT重复序列含量最丰富，其次是GGC／CCG序列。 在两种分离方法中，第二种方法所时间短，试剂消耗少，经过适当改进，可作为从花生基 因组中分离微卫星DNA的有效方法，而第一种方法则因为磁珠表面与 AFLP DNA之间的 非专一性吸附难以避兔并且耗费较大，不宜采用。本研究首次采用磁珠富集AFLP片段中 的微卫星序列，并获得了多态性SSR标记，为进一步从花生中分离大量的多态性微卫星 标记提供了可靠的实验方法。