大白菜冷相关基因的克隆及功能分析

【摘要】： 植物在冷驯化过程中会产生基因表达的变化，这一理论已经在许多植物中得到证实。本研究采用同源基因克隆法，首先利用RT-PCR技术从耐低温植物大白菜中得到了两个cDNA克隆，即RT680和RT750，再通过RACE技术分别获得了RT680的3′端、5′端及RT750的3′端。RT680加5′非翻译区和3′非翻译区的全长为955bp，内含一个663bp的开放阅读框，共编码220个氨基酸，其推导肽链的分子量为25KDa，故将其命名为cor25。RT750加3′非翻译区长度为979bp，内含一个810bp的开放阅读框，可编码269个氨基酸，推导肽链的分子量为30KDa，故将其命名为cor30。经序列及功能分析，表明二者都是冷相关基因。经同源查找及序列比较，发现cor25和cor30的氨基酸序列与拟南芥COR47的同源性分别为53.8％和59.4％，与拟南芥ERD10的同源性分别为59.4％和60.2％。 对cor25的拷贝数和表达调控进行了检测。Southern杂交表明，cor25在大白菜基因组中可能存在多个拷贝。Northern杂交表明，cor25的表达可以分别受低温、干旱及ABA的诱导。低温(5℃)处理2h后，cor25的表达水平随时间的延长迅速提高，至1d时已达最大值，并且在低温诱导10d时仍维持在这样的水平。冷驯化植株回到正常温度(26℃)后，cor25的转录水平在2h内迅速降低。干旱处理2h后，cor25的表达量迅速提高，并远远超过了低温处理8h的表达量。经外源施用100μM ABA处理4h后，也可以诱导cor25的表达。根据表达模式的研究推测，cor25在低温诱导的失水过程中对细胞具有保护作用。 进一步对cor25进行了遗传转化研究。将cor25成熟蛋白的编码区构建到pET30a载体系统，并将该重组质粒导入宿主菌BL21，经IPTG诱导后表达了目的蛋白。将cor25插入到载体pCAMBIA2300的多克隆位点后，用 冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105，进一步对烟草品种“百日红” 及水稻品种“1826”进行了转化。