番茄Tm-2～2基因在烟草中的表达及其编码蛋白特异氨基酸决定对病毒的抗性

【摘要】： 番茄(Lycopersicon．esculentum Miller)的Tm-2~2基因是一个抗Tobamovirus属病毒、属于NBS-LRR家族的抗病基因，与Tm-2基因均来源于野生种L．chilense，它位于第九号染色体长臂、靠近着丝点处，与基因nv紧密连锁，Tm-2~2和Tm-2与感病基因tm-2互为等位基因，拥有Tm-2~2基因的番茄感染病毒株系ToMV-2a，抗其它5个Tobamovius属病毒。Tm-2~2基因及其等位基因Tm-2和tm-2的ORF全长2586bp，编码有861个氨基酸，分子量为98.8kDa，PI值为8.4。Tm-2~2与Tm-2、tm-2基因分别有99.7％和97.7％的同源性。Tm-2~2基因及其等位基因在N末端的前90个氨基酸没有任何差异；第91-483个氨基酸构成了NBS结构域，Tm-2~2与Tm-2、tm-2基因的编码蛋白分别有2个和6个氨基酸的差异；在LRR(Leucine-rich Repeats)结构域的15个重复序列中，Tm-2~2与tm-2有32个氨基酸的差异，与Tm-2有2个氨基酸的差异，这种差异氨基酸的不均一分布表明Tm-2~2具有抗病特异性。 为了了解Tm-2~2基因的特性、功能及抗病机制，研究工作从三个方面进行，首先将Tm-2~2基因转化同科异属的烟草SR1，以确定Tm-2~2基因在模式植物的表达的可能性和功能的完整性。其次，通过氨基酸序列和结构的比较，确定Tm-2~2基因的编码蛋白与ToMV病毒在抗病反应中相互识别的特异氨基酸及其功能；然后，应用重组DNA技术，互换Tm-2~2基因和tm-2基因的对应结构域，构建嵌合基因，获得嵌合蛋白表达的转化体，验证Tm-2~2编码蛋白中变异氨基酸的作用。结果如下： 1．Tm-2~2抗病基因转化烟草SR1共获得了13个拥有自主启动子和14个具有CaMV35S启动子的纯合转基因株系，两种类型的转化体除了对ToMV-2a感病外，对接种的其它5个病毒株系ToMV-0、ToMV-2、ToMV-1、TMV-U和TMV-Cg均表现抗病。这表明，Tm-2~2基因可以在不同遗传背景的受体细胞中自主表达，同科不同属的物种之间的基因转移并不影响基因的表达和抗病特异性。Tm-2~2基因在烟草的表达有三个特点：1)．不受基因型的影响，在纯合和杂合状态下均表现抗病特异性；2)．Tm-2~2基因在烟草基因组DNA为显性单拷贝的基因整合，并在自交后代中稳定遗传，其后代分离符合孟德尔遗传分离规律；3)．Tm-2~2基因自主启动子与CaMV 35S启动子的表达作用不同，pTM47转化体感染ToMV-2a时表现为细胞凋亡的感病症状。 2．为了进一步了解Tm-2~2的抗病机制，对两类转化体植株抗病反应 福建农林大学 博士学位论文 摘要 中相关的MP反应蛋白基因伽护204)、病程相关蛋白基因(朋一Ia)和RNA 决定的RNA多聚酶基因(R办护)进行了检测，结果显示:1).pTM47转化 体对接种的ToMV一2a表现感病，没有诱导PR一1a基因的表达;pTM47 转化体对接种的病毒株系ToMV一0、ToMV一1、ToMV一2、TMV一U、 ToMV一Cg表现抗病，其抗病反应能够诱导PR一1a基因的表达;2).pTM47 转化体和pTM49转化体接种ToMV一o、ToMV一2和ToMV一2a毒株以后， 均能诱导A刀尸204基因的表达;不能诱导RdRP基因的表达。因此，可 以认为Tm一22基因的编码蛋白与复合蛋白转录因子有关，在抗病反应中 能够诱导五刃沪204和尸尺一Ia基因的表达，与RdRP基因的转录没有直接 的联系。根据R基因的护卫学说，Tm一22与MIP204可能拥有相互协同的 护卫关系，并在抗病反应中诱导病程相关基因的表达。 3.对Tm一22基因及其等位基因编码蛋白的氨基酸序列进行了分析，并 比较了已经公布的R基因的同源序列，结果显示:l).Tm一22基因及其等位 基因的编码蛋白属于LZ一(NB一ARC)一LRR结构的膜蛋白，在CC结构域 的90个氨基酸中，有4个保守序列拥有(FR)XLXXX的亮氨酸拉链结 构(Lz，Leueine 21即er Motifs);2).在NBs结构域的392个氨基酸中，由 9个具有ARC结构的基序组成，并拥有三个保守序列 vv大JXGMXGXGKTTLA、L(1尸犷)(V几)LDDV(W月O)和SFJIXTTRDXXV， 分别被称为P一loop、激酶2和激酶3a结构，与人类(APaf-1)和线虫(C ED一4) 的同源结构极其类似，表明Tm一22基因的编码蛋白是一个具有受体结构、 激酶特性的膜蛋白，其功能是参与细胞内的离子交换、磷酸化和蛋白之间 的特异反应。Tm一22基因与tm一2基因编码氨基酸的差异没有发生在这三个 保守序列之中;3).亮氨酸重复序列(LRR，Leucine一rich RePeats)位于C 末端，共有354个氨基酸、巧个LRR组成，其结构为LxxL双LxxLxL双 (N/C/T)x(x)LxxIP。。Tm一夕基因的编码蛋白在该区与tm一2有32个 氨基酸的差异，主要集中在第10、11和12个亮氨酸重复序列中，与Tm一2 有两个氨基酸的差异，仅仅是位于第12个亮氨酸重复序列中的767和769 两个位点，这表明:第一，LRR是Tm一22基因和Tm一2基因编码蛋白对病 毒识别的特异区段;第二，767和769两个位点的差异氨基酸是Tm一22基 因和Tm一2基因编码蛋白对病毒识别的特异位点。 4.应用分子生物学方法和DNA重组技术，构建4对互换DNA片断 的嵌合基因，经遗传转化、分子鉴定和基因测序，获得嵌合基因表达的转 化体烟草，ToMV一O、ToMV一2和ToMV一2a三个病毒株系接种结果表明: 福建农林大学 博士学位论文 摘要 1).只含有Tm一22编码蛋白第6一15个LRR的四个嵌合基