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龙眼体细胞胚胎发生过程中的基因差别表达

王凤华  
【摘要】: 龙眼胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生与合子胚的发育过程基本相同,依次经过愈伤组织、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚以及成熟胚等阶段。通过对2,4-D浓度及生长发育时间的控制获得了高度同步化的各发育阶段体胚材料。 采用SDS法、CTAB法、LiCl沉淀法均可从龙眼胚性培养物提取高质量的DNA。LiCl沉淀法简便、快捷、经济且提取的DNA较前两者质量更高,是适合用于胚性培养物DNA提取的一种方法。采用RNA抽提试剂盒提取的RNA适合mRNA差别显示分析。 本试验首次建立了龙眼胚性培养物的mRNA差别显示技术,并利用此技术对龙眼体细胞胚胎发生整个过程中的mRNA变化进行分析,结果获得了30条差异cDNA片段,经Northern和反Northern杂交获得阳性片段5条(longan1、longan2、longan3、longan4、longan4’),其中longan1在龙眼体胚的胚性愈伤组织和球形胚阶段表达;longan2为组成型表达,即存在于整个体胚发生过程中;longan3在球形胚和鱼雷形胚阶段特异表达;longan4、longan4’在子叶形胚阶段特异表达。 碱基序列分析表明,longan1在3’端存在一个开放阅读框(ORF),longan2、longan3分别在5’端存在一个开放阅读框,longan1在3’方向,longan2、longan3在5’方向均没有终止密码子,所以可能往相应的方向延伸仍为各自的ORF,因此可以通过RACE或者筛选cDNA文库的办法来获得它们的全长cDNA。登陆Genbank进行同源性比较发现longan2、longan3、longan4、longan4’均没有同源基因,而longan1与番茄apx基因具有较高的同源性(92%),推测longan1可能是龙眼体细胞胚胎中存在的apx基因。 龙眼体细胞胚胎发生过程中不仅mRNA的种类和数量存在明显变化,而且蛋白质的种类和数量也存在显著变化。采用蛋白质水平双向电泳技术研究龙眼体胚发生过程中的蛋白质变化,获得13个特异蛋白;分析发现这些特异蛋白的等电点与龙眼体细胞胚胎发育进程相关,随着发育进程的推进,特异蛋白的等电点呈降低趋势。推测龙眼体胚的发育与特异蛋白的酸碱性相关。 分析mRNA差别显示的结果和蛋白质双向电泳结果,发现龙眼在胚性愈伤组织和球形胚阶段,差异表达的mRNA多于后期阶段(子叶形胚和成熟胚阶段),但蛋白质却较后期少。推测胚性愈伤组织阶段和球形胚阶段某些基因正处于转录mRNA或以mRNP的形式存在,为以后体胚发育作准备,此后由于mRNA翻译产生大量特异蛋白,促使了特定阶段体细胞胚胎的发生与发育。


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