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水稻瘤矮病毒部分基因组片段的克隆及序列分析

范国成  
【摘要】:本文完成了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)中国广东信宜分离物(RGDV-C)部分基因组片段的克隆及其全序列测定,并首次报道了S12片段的全序列。根据水稻瘤矮病毒泰国分离物(RGDV-T)的末端及保守序列设计引物,利用RT-PCR技术,以RGDV-C基因组dsRNA为模板,扩增获得RGDV-C的S2(AY556484)、S3(AY559408)、S8(AY216767)、S9(AY556483)、S10(AY559406)和S11(为AY559407)的全序列。序列比较表明RGDV-C与RGDV-T相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为91.9%-98.1%和96.6%-98.7%,它们之间核苷酸变异主要是同类碱基的转换,即G-A或C-T;而且大多数变异发生在密码子的第三位碱基上,不引起蛋白质水平上的变化。在氨基酸水平上,也多是同类氨基酸的替代,仅有RGDV-C S11片段编码的aa211处存在一个Leu却失。RGDV-C与RGDV-T相应片段的GC含量、编码区和非编码区的长度、末端保守序列、基因组片段特异反向重复序列等基因组组织结构上基本一致;进一步以其编码的外层衣壳蛋白在同属内作系统进化以及病毒粒体被严格限制于薄壁细胞、致瘤特性分析显示,RGDV与WTV比RGDV与RDV具有更大的相似性。 在完成RGDV-C已知基因组片段同源克隆的基础上,采用了一种克隆dsRNA病毒未知基因组片段的新方法——单引物扩增技术,首次克隆了RGDV基因组S12片段,并测定了全序列。这是国际上首次报道RGDV S12片段的全序列。结果表明:RGDV基因组S12片段全长共有853bp,存在RGDV所具有的特征末端保守序列(5'GG—UGAU 3'),序列中有多个反向重复序列。与WTV和RDV各分离物基因组S12片段的全序列相比,核苷酸同源性约为50%。计算机分析表明,该片段可能含有二个开放阅读框(ORF),是RGDV所完成全序列测定的片段中唯一采用多顺反子策略进行编码的基因片段。 最后,结合多种软件对以上序列进行生物信息学分析。在保守结构域分析时表明,植物呼肠孤病毒属中,S8片段编码的主要外层衣壳蛋白具有相同的保守结构域;RGDV S10片段编码的36kDa蛋白,RDV S9片段编码的Pns9蛋白,WTV S11片段编码的P9蛋白也具有相同的保守结构域;RGDV S11片段编码的Pns11蛋白(40kDa)与WTV、RDV S10片段编码的Pns11、Pns10等非结构蛋白不但具有相同的保守结构域,而且还与抗菌素整合酶家族具有一部分 福建农林大学硕士学位论文 相同的保守结构域,具有该保守结构域的抗菌素整合酶家族成员可对DNA底 物进行一系列的交错剪接,在无需外界提供能量的条件下,通过酪氨酸酶促反 应,将该蛋白共价结合到DNA链上。对RGDVsg片段编码的PnSg蛋白分析 表明,该蛋白与包柔氏螺旋体菌依赖ATp的C扣蛋白水解酶有21 .8%的氨基酸 序列同源性。


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