高赖氨酸蛋白基因转化银耳研究

【摘要】：蛋白质是人的营养要素，它由20多种氨基酸组成，其中有10种氨基酸人不能合成，只能从食物中摄取，称之为必需氨基酸。赖氨酸是十种必需氨基酸之一，赖氨酸具有多种生物学功能，这些功能包括：增进食欲、提高血液中血红蛋白含量；赖氨酸铝盐可治胃溃疡等。人体缺少赖氨酸会出现体重轻、骨骼发育不全、也会降低人体对其它氨基酸的吸收，营养学家把它称为“第一缺乏氨基酸”。 赖氨酸蛋白基因转入具有较高食药用价值的银耳，合成具有生物活性的赖氨酸蛋白，相当于在营养丰富的银耳中添加新的营养保健因子，既提高银耳的营养保健价值，又增加人体对膳食中蛋白质的利用率。 本研究在探索银耳遗传转化体系的基础上，构建了高赖氨酸蛋白基因表达载体，利用限制性内切酶介导整合法(R E M I)，首次把高赖氨酸蛋白基因导入银耳芽孢，获得了转基因菌株。对转基因菌株进行分子检测，证实了外源基因已整合到银耳基因组中。氨基酸含量测定表明，转基因银耳中赖氨酸含量得到不同程度的提高。具体结果如下： 1．银耳原生质体制备与再生条件优化 以芽孢、菌丝体和子实体为材料，通过正交实验，考察了菌株、酶浓度、酶解时间以及酶解温度对原生质体产率和再生率的影响，结果显示：实验材料对原生质体产量影响最大，以芽孢为材料原生质体产量可达到2.75×10~7个／ml，而菌丝体和子实体的原生质体产量仅为2.5×10~6个／ml和1.0×10~6个／ml；在35℃下酶解，原生质体产量最高；溶壁酶浓度在1％～3％之间对原生质体产量影响不大：不同菌株原生质体产量差异不显著。本实验还研究了稳渗剂浓度对原生质体再生率的影响，结果表明，0.5mol／L～0.7 mol／L的KCI对原生质体再生没有显著差异，再生率最高为32.3％。 福建农林大学硕士学位论文 中文摘要 对比紫外线与Y射线对银耳芽抱的诱变效应，Y射线诱变获得了48 个缺陷型菌株，经传代后都被修复，没有获得稳定的突变体，紫外线诱变 后有62个缺陷型菌株，经过传代后获得2株稳定的缺陷型突变体，获得两 个营养缺陷型菌株，其中一株Tausn经鉴定是肌醇缺陷型。突变体Tausn 的生长迟缓期比野生型多3天，生长速度较慢。 3.高赖氨酸蛋白基因转化银耳及分子检测 以pBR一1 ys为中间载体，把pBR一lys的Pubi启动子置换成P35S，构建成 表达载体pCB一1 ys。应用REMI介导转化银耳芽抱，获得众多的转化子，核 rDNA检测结果和营养缺陷型检验结果表明，这些转化子均是银耳芽抱。PCR 检测结果:转化子携带P35S启动子、Lys基因、GUS基因、hPt基因、Tnos 终止子。转基因银耳芽抱对潮霉素的抗性水平可达到巧oug/m1以上，大部 分转化子检测到GUS活性。 4.转基因菌株赖氨酸含量测定 利用氨基酸自动分析仪，对潮霉素抗性较强的6个转基因菌株以及对 照Tausn进行氨基酸分析，结果显示:转基因菌株的赖氨酸含量都有不同 程度的提高，其中有4株提高了11%以上，最高一株为16.57%，而且蛋白 质中氨基酸总量也有较大幅度的提高。