防病、促生植物内生芽孢杆菌的研究

【摘要】：番茄、茄子、烟草和辣椒健康植株内生细菌的分离及拮抗菌的筛选结果表明，不同种、品种及植物的不同部位，内生细菌的数量有所不同。不同作物的平均内生细菌数量为1.17×10~3～11.16×10~3cfu／g.FW：各作物植株不同部位中均以果中内生细菌的数量最少，根和茎中的内生菌数量较多。拮抗测定表明，各植物体内均存在对黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumberinum)和番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)具有拮抗作用的内生细菌：对番茄青枯病菌具有拮抗作用的植物内生细菌占内生细菌总数的比例较低，只有13.7～18.6％，平均为16.4％；而对黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用的内生细菌比例较高，为27.1～30.3％，平均为28.3％。 从植物体内分离筛选出168株对黄瓜枯萎或番茄青枯病菌能形成明显抑菌带或抑菌圈的拮抗细菌，再从中筛选出19株对辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)有较好拮抗作用的菌株，其中2号、13号、20号、TL6、TMS2、TB2和QEL17个菌株对以上三种病原菌都有一定的拮抗作用。从拮抗辣椒疫病菌的菌株中筛选出20号、22号、TL6、TB1、TB2和EPL8等6菌株对番茄有较好促生作用，对辣椒采后果实疫病有一定控制效果，且能进入番茄和辣椒体内的菌株。经鉴定，6株有抑菌、促生作用的内生细菌均为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，16S rRNA基因序列分析表明6株菌株均为枯草芽孢杆菌的近缘种，其中TB2用Biolog系统鉴定为解淀粉链芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，EPL8和22号菌株用VITEK-32鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 防病试验表明，6株内生细菌对辣椒离体果和幼苗疫病均有一定的防治效果，生防菌菌液处理可延迟发病、抑制病害扩展速度。浸种处理的苗接种辣椒疫病菌后20 d防病效果可达17.8～74.6％；浸种处理的苗接种辣椒疫病菌时再用菌液灌根处理后20 d防病效果可达30.8～80.4％；菌液喷雾处理的果接种病菌后10 d防病效果可达53.5～82.9％。另外，不同菌株对黄瓜枯萎病也有一定的防治作用。多数生防菌菌液处理的果和苗在接种生防菌1～2 d后再接种疫霉病菌的防病效果好。其中TB2菌株对辣椒疫霉引起的辣椒苗和果疫病有良好的防治效果，菌液浸种处理的苗接种病菌后20 d防病效果可达70.0％；菌液浇灌后48 h的苗接种病菌后20 d防病效果可达88.1％：菌液喷雾处理的果接种病菌后14 d防病效果可达65.2％。喷雾或浇灌菌株培养液后间隔24 h以上接种病原菌的防病效果比两者同时接种时高。生防菌菌体及其胞外分泌物均有防病作用，其胞外分泌物的速效性较好，菌体的持效性较好。 盆栽试验测定菌株对植物生长的影响表明，20号、22号、TL6、TB1、TB2和EPL8 6菌株对小白菜均有明显的促进生长作用，其中TB1、TB2对辣椒和烟草也有一定的促生作用。内生细菌可促进植物根和茎叶的生长，增加植株的鲜重和干重。 以抗利福平标记和拮抗病原真菌抗性为标记的内生性测定表明，6株菌株均能进入 福建农林大学博_l:学位论文 番茄、烟草、辣椒和茄子体内，其中以具有较好防病效果的菌株TBZ、TL6和20号菌株 在作物体内定殖菌量较大;不同内生细菌在植物体内的定殖与其宿土来源有一定的关系、 多数菌株在原宿主上的定殖菌量相对较多。浸种、灌根及涂抹叶片等方法接种后均能使 TBZ菌株进入辣椒、烟草和番茄体内，TBZ菌株在室内和田间测定均能主动进入辣椒和 烟草体内定殖，并从根部往茎叶组织传导。 防病机理测定结果表明，TBZ菌株胞外分泌物对病菌菌丝生长、抱子囊形成和游动 抱子释放均有明显的抑制作用。菌液可诱导植物O犷及抗性相关酶的变化，在菌液与病 菌同时接种于辣椒果时诱导作用可相互影响。疫霉菌处理可使辣椒果的丙二醛(MOA) 含量和过氧化物酶(P oD)、超氧化歧化酶(S OD)、过氧化氢酶(CAT)活性出现明显的峰 值;菌液处理也可诱导辣椒超氧化歧化酶500、CAT和POD活性增强;但菌液与病 菌共同处理后，辣椒果的MOA含量和SOD、POO以及CAT的活性均较低，与清水对 照接近，表现出一种相对稳定的状态。菌液处理后辣椒苗体内O犷产生速率及SOD、 CAT和POD的活性均会上升，之后又下降，其中O厂产生速率和500的活性在Zd以 后均比清水低;而队L酶的活性则在菌液处理后一直比清水对照低。在菌液处理ld 后的苗接种病菌后除队L活性快速提高外，O犷产生速率及SOD、CAT、POD的活性 及MDA的含量变化均比接种病菌的处理来得较缓和，体现病菌受到抑制作用。 TBZ对辣椒和烟草体内内生微生物种群影响测定表明，TBZ接入植株体内后对植物 固有内生细菌种群结构产生了影响，使体内的拮抗细菌比例大大提高，群体的生态功能 发生了变化。 抗菌蛋白研究表明，TBZ可以产生多种具有不同抗菌活性的物质，且会产生可诱导 辣椒抗疫病的物质，其中对热稳定、抗紫外线的抗菌物质，经SDs一PAGE、高效液相色 谱(HPLC)、MALDI一TOF质谱等检测，是分子量为1030一1123Da和分子量为1421一1543 Da的两类小分子脂多肤物质。 利用枯草芽抱杆菌表达载体pUS186将绿色荧光蛋白基因转入野生型TBZ菌株中，构 建了含加基因的工程菌，工程菌的拮抗作用与野生菌株相当，但尚未检测到荧光。