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银耳遗传转化系统的建立及三个品质基因的转化

谢宝贵  
【摘要】:银耳(Tremella fuciformis Berk.)又称白木耳,是一种已大面积人工栽培、被人们普遍接受的滋补食品。本研究应用基因工程技术,遗传转化高赖氨酸蛋白基因、人乳铁蛋白基因、人胰岛素基因和蜜蜂抗菌肽基因,以期进一步提高银耳的营养保健品质。 文献检索结果,从1976年至今,未见银耳遗传转化方面的研究报道。 1 建立了银耳遗传转化系统 研究出银耳遗传转化的标记基因:研究了银耳、大肠杆菌和农杆菌对13种抗生素的敏感性,筛选出银耳芽孢敏感的两种抗菌素——潮霉素、卡那霉素,确定潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、新霉素磷酸转移酶基因(nptII)作为银耳遗传转化的筛选标记基因;测定了银耳的β-半乳糖苷酶(lac z)和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)的活性,确定GUS作为银耳遗传转化的报告基因。通过诱变,获得二个营养缺陷型菌株,其中一个是肌醇缺陷型,可应用于营养缺陷型标记的研究。 建立银耳原生质体制备与再生系统:应用正交设计优化银耳原生质体的制备条件,原生质体产量可达到2.75×10~7个/mL;对原生质体的再生条件进行研究,再生率最高可达32.3%。原生质体的浓度与再生率均达到作为遗传转化材料的要求。 研究出2种用原生质体转化的方法:即PEG介导和REMI转化,用20~30μg质粒DNA进行转化,这两种方法的转化率分别为1593和2140个转化子/μgDNA,用微量的DNA(50 ng)进行转化,其转化率分别达到266000和30000个转化子/μgDNA。 研究出3种用芽孢直接转化的方法:即LiAc转化法、超声波转化法和物化结合转化法,不需要制备原生质体,用带壁的细胞进行转化。7.5~30μg质粒DNA进行转化,上述三种方法的转化率分别为304、750和2688个转化子/μgDNA。用微量的质粒DNA(60 ng)进行超声波转化,转化率最高可达17000个转化子/μg DNA;本研究的最高转化率,与香菇(转化率为6个转化子/μg DNA)相比,提高了2833倍。 2 遗传转化三个品质基因 高赖氨酸蛋白基因(lys):赖氨酸是人体必需氨基酸,也是以大米为主食人群的第一限制性氨基酸,具有重要的营养价值。应用REMI介导,高赖氨酸蛋白基因转化银耳,获得大量的抗性菌株,对26抗性菌株进行GUS活性检测,22个阳性、4个阴性;对17 福建农林大学博士学位论文 谢宝贵:摘要 个抗性菌株的潮霉素抗性检测,在Zoou岁mL的浓度下都能生长:对8个抗性菌株进行 PcR检测(包括lys基因、355启动子序列、GUs基因、hPt基因和Tnos终止子序列), 均为阳性.测定了7个菌株的氨基酸组成,与受体菌株(T认us 11)相比,赖氨酸含量提 高16%~16.6%,有3个菌株的赖氨酸含量增幅超过巧%,其中几usll一16的增幅最高, 达到16.6%。 人胰岛紊基因(BC减):胰岛素是糖尿病的特效药,目前主要从动物胰腺中提取,基 因工程重组人胰岛素药物已开发成功,并在临床上应用,但生产成本较高.本研究合成 了植物密码子偏好的人胰岛素基因(刀C减),并从中克隆出人胰岛素A链、B链基因,构 建了银耳表达载体,分别用REMI法、电击法和PEG法把上述三个基因导入银耳芽抱, 都得到大量的抗性菌株,GUS检测了BCAZI株(18株阳性,3株阴性)、A15株(12株 阳性,3株阴性)、B6株(5株阳性,1株阴性),PcR检测(包括目的基因、Gus基因 和Thos终止子序列)了BCA10株、A7株、B6株,均为阳性。 蜜蜂抗菌肚基因认尸):抗菌肤具有广谱抗菌活性、不会使病菌产生抗药性,可提 高农产品的卫生品质,是一类很有前景的肤类抗生素,已引起科学家们的重视.本研究 合成了蜜蜂抗菌肤基因,应用LIAc法和PEG法把该基因导入银耳芽抱,获得大量抗性 菌株,GUS活性检测了19个抗性菌株,其中只有1个阴性,其它都为阳性。PCR检测(包 括目的基因、GUS基因和Thos终止子序列)10个抗性菌株,均为阳性。测定了4个菌 株对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,AP一39菌体提取液的抑菌率为25.4%、培养液的抑菌 率达到53.8%。 银耳的双型性(芽抱和菌丝体)赋予它具有原核生物和酵母菌的生长特点,又有高 等生物分化发育过程.本论文研究出银耳的高效遗传转化技术,转化效率很高。因此, 银耳可作为一种新的模式生物应用于生命科学研究。银耳是一种食药兼用的真菌,即可 进行大规模人工栽培生产子实体,也可应用发酵技术培养芽抱营养体,不论是子实体还 是芽抱都可以食用.银耳菌种生产是无性繁殖,后代不会发生分离。如果作为外源基因 表达的生物反应器,基因产品的生产方式有两种选择,即种植子实体或发酵生产,它将 促进基因工程产品的研发与生产。


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