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两种食用菌活性蛋白的分离纯化及其抗病特性

吴丽萍  
【摘要】:植物病毒病害造成重大的经济损失。解决作物上植物病毒的危害,一直是许多研究者的目标。从生物体中提取抗植物病毒物质是防治植物病毒病害的方法之一。本实验从食用菌中获得了两种抗植物病毒蛋白,其结果如下: 用离子交换层析(CM-Sepharose FF)和凝胶层析(Superdex~(TM) 75)方法,从新鲜食用菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)子实体中分离纯化出一碱性蛋白y3,经SDS-PAGE及PAGE确定为单亚基组成,MALDI-TOF质谱确定其分子量为12.3kDa。以碘酸—Schiff染色法和酚—硫酸法测定蛋白含糖量高达30%。对其氨基酸组成进行分析后表明含有大量的精氨酸和天冬酰胺。y3蛋白N-端氨基酸序列为NRDVAACARFIDDFCDTLTP,经NCBI中Blast比较未发现同源序列,可能为一新的蛋白序列。在Swiss-Prot上登录号为P83477。制备了高效价抗血清,其效价为2~(-12)-2~(-13),Western-Blot表明抗血清特异性高。毛头鬼伞菌丝体发酵后用ELISA和Western-Blot检测到菌丝体中同样含有蛋白y3。 y3蛋白活性检测结果显示:当其浓度为12.5μg.mL~(-1)时,在心叶烟枯斑寄主上对烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)的侵染抑制率达83.0%;y3蛋白对兔血凝集活性滴度为2~(-5),对人血凝集活性滴度为2~(-6),其浓度分别为1.562μg.mL~(-1)和0.781μg.mL~(-1),凝集活性能被半乳糖、γ-球蛋白、麦芽糖抑制;对三种细胞即胃癌细胞株MGC80-3、肝癌细胞SMMC-7721,及肺癌细胞SPC-A_1体外抗性测定结果表明,y3蛋白对MGC80-3和SPC-A_1的抑制中浓度约为12.5μg.mL~(-1),对SMMC-7721的抑制中浓度则较高,约30μg.mL~(-1)形态观察表明蛋白对SPC-A_1具有类似诱导凋亡作用;对供试的植物病原真菌和细菌均无抑制作用。 采用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析(DEAE-SepharoseFF)和凝胶层析(Sephacryl~(TM)-200 High Resolution)方法,从新鲜食用菌榆黄蘑(Plearotus citrinopileatus)中进行了抗病毒蛋白的纯化,结果获得一纯化蛋白YP46-46,经SDS-PAGE可确定为一约27.4 kDa的单亚基的蛋白。以碘酸—Schiff染色法和酚—硫酸法测定该蛋白不含糖。对其氨基酸组成进行分析后表明含有大量的酸性氨基酸。YP46-46 N-端序列为VYINKLTPPCGTMYYACEAV,经NCBI中Blast比较没发现同源序列,可能为一新的蛋白序列。在Swiss-Prot上登录号为P83481。制备了高效价抗血清,其效价为2~(-13)-2~(-14),Western-Blot 福建农林大学博士学位论文 表明抗血清特异性高。 以半叶法在枯斑寄主心叶烟上检测Y尹46训陌蛋白对TMV的抑制率,发 现有较好的抗TM万活性,其抑制们Mv的中浓度C50为0.240陀.功L.l OY卫46一6 蛋白对兔和人血凝集活性滴度为2一7,其浓度分别为0.2 19陀.mL一利用 MGCS压3、SMMc-7721,及SPc·A:检测蛋白的体外抗肿瘤活性,其Ics。约 为加陀.mL一,.YP4“6蛋白对供试的植物病原真菌和细菌均无抑制作用。 对y3蛋白的抗TM,机制作了初步分析。结果表明y3蛋白对TM,不仅 具有较强的体外钝化作用,而且能抑制病毒在系统寄主烟草丸26内的复制。 在心叶烟枯斑寄主上对TMv的侵染抑制中浓度约为2.0陀.mL’,;最适工作pH 为9.0;TM[V与y3蛋白混合后用RN姗处理,测得侵染率为61.74%,比未 用RNase处理的对照降低了38.26%,说明y3蛋白对TMv的外壳蛋白具有一 定的破坏作用;蛋白能抑制TMV-CP在体外的聚合,还能阻止 TMV-CP与其 抗体的结合;另外电镜观察发现y3可使部分rMV粒体发生裂解,变短。通 过叶绿素含盘检测显示蛋白能在一定程度上减缓植株感病后的症状. 提取毛头鬼伞中的总RNA,采用RACE方法和巢式一PCR技术,根据 y3蛋白N·端20个氨基酸序列设计引物进行了基因克隆。获得了y3的部分 cDNA序列以及3’端非编码区.其序列长度为414bp,其中oRF长度包括终 止密码共291饰,编码蛋白序列共96个氨基酸,3,非编码区含有123个碱基, 其中polyA为22个.经NcBI中Bl玻比较没找到同源序列,表明该基因为 一全新序列(Ge血B助k接收号:602564)。加上N一端未用来设计引物的5个 碱基,全长共101个氨基酸。等电点为8.17。该蛋白序列中有7个半耽氨 酸,可形成分子内二硫键。蛋白在Swiss一Prot登录号P83811(登录时采用 名称为CAP)。


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