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苏云金芽孢杆菌WB9的研究

黄志鹏  
【摘要】:本文对土壤中分离的苏云金芽孢杆菌WB9菌株的生理生化特性、小菜蛾和甜菜夜蛾的致病力测定、编码活性因子的基因分析、杀虫蛋白基因的克隆和表达、工业培养基的室内摇瓶优化筛选以及茶尺蠖的室内外防治试验等进行了较为系统深入的研究。 采用醋酸钠法加热处理和抗生素的分离方法,对收集自武夷山自然保护区非耕作区的200个土壤样品进行了分离,得到12株苏云金芽孢杆菌菌株,出菌率为6.0%。对WB9菌株的室内致病力测定结果表明其对小菜蛾具有高致病力、对甜菜夜蛾具有较高的致病力。 以库斯塔克亚种的8010和8311菌株以及鲇泽亚种的No.1菌株为对照,对新分离的WB5、WB7和WB9菌株的12项经典生理生化指标进行了测定。测定结果显示WB9和WB5分别与库斯塔克亚种8010和鲇泽亚种No.1的生理生化反应特性表现相同,仅在个别反应上有强弱差异。由此推测,WB9和WB5可能分属库斯塔克亚种和鲇泽亚种。 采用PCR及PCR-RFLP技术对WB9的ICP、VIP、几丁质酶和肠毒素4种活性因子的编码基因进行了分析。结果表明:该菌株含有编码ICP蛋白的cry1Aa、cry1Ab、cry1Cb、cry1Fa和cry1Ga 5个cry1基因型,编码Vip3A蛋白的vip3A基因以及编码3种肠毒素的hblA、bceT和entS基因,不含编码几丁质酶的基因。将vip3A、hblA、bceT和entS基因的PCR产物回收纯化后直接测序,利用在线的Blast软件进行同源性分析,前两个基因片段的核苷酸序列与苏云金芽孢杆菌已公布基因序列的相应片段同源性分别为99%和96-98%,bceT基因片段与蜡质芽孢杆菌已公布基因序列的相应片段同源性为97%,entS基因片段与苏云金芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌已公布基因序列的相应片段同源性为94-99%。 设计可扩增出cry1Ab基因完整的开放阅读框(ORF)的引物对F1和R1,通过PCR技术从WB9中扩增出全长的cry1Ab基因。利用高效克隆PCR产物的专


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