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GFP在南方根结线虫(Meloidogyne incogita)拮抗菌Alcaligenes faecalis研究中的应用

周莉娟  
【摘要】:植物寄生线虫是农业生产中重要的传染性病原之一,使作物减产从而给农业生产带来重大损失。至今对线虫的防治还是以化学杀线剂为主,由于化学杀线剂的高毒、高残留对人类健康及环境造成潜在威胁,因此发展以微生物为主的生物杀线剂成为未来的发展方向。BC2000就是一株分离至根际土壤的线虫拮抗菌株。 一系列室内和田间试验结果表明,BC2000作为植物生长促进剂和抗线虫生防菌剂具有潜在的应用价值,为了解该菌株在环境中的定殖、活动能力及作用方式,利用一个特殊标记对该菌株进行监测是很有必要的,而编码绿色荧光蛋白(GFP)的gfp基因就是一个最具应用前景的标记物。本研究以GFP作为拮抗菌BC2000的荧光标记物,通过标记菌表达的绿色荧光来监测它在根际及植物组织的定殖活动,并对标记菌株的生物学特性及生防功能进行研究。 用16S rRNA基因克隆、测序及序列分析比对的方法,鉴定该菌株为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)。进而利用一个带gfp和luxAB双标记基因的miniTn5转座载体,用电转化法将这几个基因插入BC2000的基因组中,利用gfp基因表达后菌落在立体荧光显微镜下发出的绿色荧光,得到一个高效表达GFP的标记菌,命名为BC2001。标记菌的基因组DNA用gfp基因的特异性引物进行PCR和Southern杂交鉴定,同时将其16S rRNA基因克隆、测序并与出发菌BC2000的16s rRNA基因序列进行两两比对,结果证明该标记菌确实是出发菌BC2000经电转化后在基因组中整合了gfp基因的突变菌株,同时通过荧光素酶活性测定证实另一个标记基因luxAB在BC2001中也得到了很好的表达。 标记菌BC2001生理生化特性研究结果表明,与出发菌BC2000比较,菌体和菌落形态没有差异,但菌株的生长出现滞后现象;虽然BC2001对温度的敏感性增强,但两种菌株生长的温度和pH范围没有变化,30℃的温度和pH7.0是这两种菌株生长的最适宜温度和酸碱度,而且最有利于标记菌BC2001中GFP的表达。对标记菌BC2001中GFP表达稳定性进行试验的结果,BC2001连续转接10次后外源基因gfp在选择性和非选择性LB平板中表


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