楷杷种质资源的RAPD分析

【摘要】：本研究以枇杷种质资源为材料,摸索出适合枇杷叶片基因组DNA的提取方法; 建立和优化了枇杷RAPD反应体系;采用RAPD标记,结合聚类分析,分别进行 了枇杷种质资源(包括11个枇杷属主要种类资源、65份枇杷种质资源、12个不同 地方来源的解放钟品种材料)的遗传多样性与亲缘关系研究,并且证明了早钟6号 是解放钟与森尾早生的杂种后代。主要研究结果如下: 一、枇杷叶片DNA提取方法的建立。针对枇杷叶片富含多糖、多酚类、色素等物 质的特点,采用改良的SDS法,以新鲜幼嫩的枇杷叶片为材料,并在提取液中加 入3%PVP,有效地克服消除了酚类物质的干扰。在DNA提取过程中。在第一次 25000g高速离心后,重复加入500μ120%SDS和1500μ15M KAc的步骤,让SDS 与多余多糖再次结合变成不溶性的十二烷基磺酸钾复合物,有效地、较彻底地消除 了糖类物质的干扰。从枇杷叶片中提取了较高纯度和产量的DNA,适宜作为枇杷 RAPD分析。 二、枇杷RAPD-PCR反应体系的优化。经过反复试验,确定适宜的PCR扩增程序 为:94℃,预变性4min:94℃变性1min,38℃退火1.5min,72℃延迟2min,45个 循环:最好一次延伸温度72℃,10min。优化的枇杷RAPD反应体系为:在扩增反 应总体积25 μl中,包含0.6 mmol·L~-1Mg~2+、500 μ mol·L~-1dNTP、300 nmol·L~-1 引物、50ng模板DNA、1.25U Taq DNA聚合酶。 三、枇杷属11个主要种类的RAPD分析。应用14个10聚体随机引物对解放钟、 森尾早生、早钟6号、贵州野生、台湾枇杷、栎叶枇杷、乌脐、白梨、洛阳青、俨 糖枇杷、湖北六二等11个枇杷种类或品种的基因组DNA进行RAPD扩增,共得 到130条扩增带,其中3条为非多态性条带,多态性程度为97.69%。聚类分析表 明,以D1=0.599进行划分时,可将枇杷的11个遗传资源分成栽培和非栽培两个 类群。 四、65份枇杷种质资源RAPD分析。利用RAPD技术对65份有代表性的枇杷种 质资源进行了遗传亲缘关系及分类研究。从所筛选的Sangon引物中选取16个10