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产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其基因克隆

黄志强  
【摘要】:本研究从福建海域的海水、海泥及海藻样品中分离到三株产碱性蛋白酶的海洋细菌菌株3B、6CW、15E,采用16S rDNA分子生物学鉴定结合细菌的常规鉴定方法,确认分离到的三个产蛋白酶的海洋细菌菌株分别是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),粘质沙雷菌(Serratia marcescens),氧化短杆菌(Brevibacterium oxydans)。其中,海洋氧化短杆菌(Brevibacterium oxydans)产碱性蛋白酶为首次报道。 对氧化短杆菌15E菌株产碱性蛋白酶的发酵条件进行研究,结果表明:在2%接种量、培养基的初始pH为9.0、装液量在20%左右、培养温度为28℃、摇床转速为200r/min的条件下培养40h时,菌体生长最适且总酶活达到最大;菌株在添加有0.5%牛肉膏、0.1%葡萄糖的酪蛋白培养基中生长和产酶均达到最佳;人工海水中的K~+、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度较为适合15E菌株生长和产酶,其中K~+对菌株产酶起关键作用。 菌株15E所分泌的碱性蛋白酶的分子量为49.0kDa,等电点为9.3,米氏常数Km为5.6×10~(-3)g/mL。该酶的最适作用温度为60℃,最适pH值为7.0-9.0;Ca~(2+)、Mg~(2+)、K~+对酶有激活作用。酶对一些变性剂如SDS、尿素、盐酸胍具有一定的耐受性;PMSF和AEBSF能抑制该蛋白酶,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶;EDTA对该蛋白酶有抑制作用,说明该蛋白可能含有金属离子。 氧化短杆菌(Brevibacterium oxydans)菌株15E碱性蛋白酶apr基因克隆结果表明,该DNA片段长度为1357nt,最大开放阅读框编码447个氨基酸。从第122个氨基酸到第144个氨基酸这段序列可能是一个跨膜区。但是,获得的序列经分析并未存在特征明显的信号肽序列。利用系统发育树分析,所克隆的序列与褐色高温单胞菌碱性蛋白酶前导序列和铜绿假单胞菌碱性蛋白酶基因处于同一个分支,说明该序列为编码碱性蛋白酶的基因。同源性分析结果显示,该蛋白可能是一个结合蛋白酶类,存在一个活性中心。


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