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核盘菌与拟南芥互作的分子机制研究

王爱荣  
【摘要】:核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是世界粮油作物、蔬菜等农作物生产上的分布最广、为害最严重的病害之一。我国油菜、大豆和保护地蔬菜的菌核病问题尤为突出,严重时会导致毁灭性的损失。该菌寄主范围极广,不具典型的基因对基因关系,给研究其致病和抗病分子机制带来了极大的困难,至今对其侵染致病的分子机制和植物对核盘菌的抗性机制仍不甚明了。为了研究植物对核盘菌的抗性机制,采用从拟南芥病株上分离鉴定的核盘菌菌株接种拟南芥野生型Col-4,分别于接种后0、4、8、12、16、20、24、48取样,提取各样本的总RNA,以PR1(Pathogenosis-related protein 1)和PDF1.2(plant defensin 1.2)基因片段为探针进行Northern blot杂交,分析核盘菌侵染后拟南芥病程相关蛋白基因的表达动态,同时对相应时间段的病菌侵染过程及组织和症状变化进行了观察。Northern blot分析表明:PDF1.2在接种12h后开始表达,在之后的4个时间段其表达量逐步增强;而PR1在整个过程中表达量变化不大。扫描电镜观察及组织和症状观察结果表明,接种8h时菌丝开始围绕植物表面细胞生长,菌丝顶端膨大产生许多分支,并形成一些小的侵染垫,但植物叶片上还没有病斑形成;12h时在菌丝块周围可以清楚的看见旺盛生长的气生菌丝,菌丝块下面及周围的叶片上开始产生零星病斑,16h时零星病斑连成片,20h病斑进一步扩大,在菌丝块周围可明显的看到褐色病斑,24h时病斑已达到一定规模,病斑表面可见有许多气生菌丝,在病斑边缘可见有菌丝顶端从表皮下面伸出并形成许多分支,但此时的病斑还接近圆形,等到30h时由于菌丝沿叶脉生长得快,病斑呈现椭圆形或梭形。综合以上的结果,我们认为PDF1.2的表达动态与拟南芥-核盘菌亲和互作的过程存在对应关系,推出拟南芥对核盘菌的抗性反应可能受茉莉酸/乙烯信号途径调控。 鉴于PDF1.2基因的表达情况,选取4h、12h、24h、48h四个时间段的拟南芥材料,以接种核盘菌拟南芥mRNA作为tester,正常组织的mRNA为driver进行抑制消减杂交,将抑制消减杂交的第二轮PCR产物克隆进T载体构建包括2592个克隆的cDNA文库。以正向探针(接种核盘菌的拟南芥mRNA作为tester,未接种对照组织的mRNA为driver,进行SSH实验后的第二轮PCR产物)和反向探针(接种核盘菌的拟南芥mRNA作为driver,正常组织的mRNA为test,进行SSH实验后的第二轮PCR产物)进行菌落杂交筛选cDNA文库,将获得的差异克隆以接种和未接种的拟南芥样品cDNA为探针进行反向Northern blot分析进一步鉴定出受核盘菌诱导表达的拟南芥防御反应相关基因。挑取反向Northern blot杂交结果差异明显的46个克隆进行测序,共得到38个拟南芥的非冗余序列。进一步分析这些基因的功能,结果发现已知功能的序列有22条(57%),未知功能的序列16条(43%);防卫基因和信号传导蛋白基因占所有基因的18%。RT-PCR分析表明这些基因确实是由核盘菌诱导表达的。为了进一步验证SSH的结果,从ABRC库中得到部分基因的T-DNA插入失活突变体,经接种核盘菌后发现几乎所有的突变体对核盘


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