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根结线虫寄生真菌资源与淡紫拟青霉PL89的研究

肖顺  
【摘要】:从全省9个县(市)18种作物上根结线虫的雌虫、卵和卵囊上共获得888个寄生性真菌分离物,隶属于26属,鉴定出17种,3个变种.其中厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、茄病镰孢(Fusarium solani)和尖孢镰孢(F. oxysporum)是福建省根结线虫的寄生性真菌优势种群,分别占分离物总数的22.30%、19.14%、17.23%和9.57%.根结线虫的寄生真菌类型以卵囊寄生真菌为主.从175株厚垣孢普可尼亚菌(P. chlamydosporia)鉴定出厚孢变种(P. chlamydosporia var. chlamydosporia)143株和串孢变种(P. chlamydosporia var.catenulata)32株,其中厚孢变种为优势变种.厚孢变种与串孢变种在自然界中存在的比例为4.47:1. 构建“几丁质平板筛选、几丁质酶活测定、对根结线虫致病力测定”的寄生性真菌高效菌株筛选模型,从123株淡紫拟青霉分离物中筛选获得5株高产几丁质酶、对根结线虫高致病力的菌株021117-89(即PL89)、021117-77、021029-27、021020-65、021020-36.采用明胶琼脂平板法与几丁质平板法相结合,从175株厚垣孢普可尼亚菌分离物中筛选获得5株产蛋白酶能力与产几丁质酶能力均较强的菌株010727-1、021020-30、021120-48、021020-34、021120-81. 对菌株PL89的发酵生物学特性的研究结果表明,PL89液体发酵的适宜C/N为5:1,C/N为20:1有利于PL89固体平板的产孢;碳源浓度对PL89液体培养大量产孢出现的时间和持续的时间有一定的影响,碳源浓度为1mol·L~(-1)可使液体发酵大量产孢时间提前,适宜PL89固体平板产孢的碳源浓度为0.5mol·L~(-1);菌株对不同的碳、氮源种类利用能力不同,结构复杂的碳源(可溶性淀粉)及有机氮源有利于PL89的生长;主要元素缺失对菌株PL89的生长影响很大,其中缺失磷、硫和镁等元素对PL89的液体发酵产孢的减产率分别达90.8%,90.6%和83.1%,对固体平板的产孢减产率分别为83.6%,59.8%和58.8%;微量元素添加培养试验结果表明,菌株PL89对铜离子和铝离子较敏感,添加一定浓度的锰离子、镁离子和元素硼对PL89液体发酵的产孢及生物量的形成有显著的促进作用;添加适当浓度的维生素叶酸和维生素B_2均十分有利于PL89液体发酵孢子产量的增加. 根据PL89菌株营养需求特性,研制了虾壳粉培养基.通过单因素试验证明细度为过孔径为149μm标准筛的几丁质粉末对菌株产几丁质酶的诱导性最强,同时添加蛋白胨能使产酶高峰提早、产酶量提高;多因素正交试验确定在添加2g·L~(-1)细度为过孔径为149μm标准筛的几丁质粉末、2g·L~(-1)蛋白胨、1g·L~(-1) KH_2PO_4、0.5g·L~(-1)MgSO_4、0.2g·L~(-1)CaCl_2和0.2g·L~(-1)NaCl的培养基中接入经马铃薯蔗糖培养基(PSA)活化10d的菌碟,接种量为6×10~9个孢子·L~(-1),500mL摇瓶装量150mL,在28℃、转速为150r·min~(-1)的条件下培养3d,发酵液中几丁质酶活最高,可达到0.11U·mL~(-1). 用菌株筛选模型获得的PL89菌株具有很强的分解和利用几丁质的能力,适合在以虾壳为主要成分的虾壳粉培养基上生长.通过对虾壳粉的成分进行测定分析,结果表明,虾壳粉培养基所含的营养全面,碳源浓度和碳氮源比率适合;实验结果表明,虾壳粉培养基比马铃薯蔗糖培养基更适宜于菌株PL89液体发酵的产孢及生物量的形成;用虾壳粉作为唯一的营养来源液


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