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厚荚相思转基因受体系统建立及遗传转化初步研究

王宇  
【摘要】: 本试验以厚荚相思茎段、叶片和瘤状物为外植体,采用不同的培养条件对上述外植体进行培养,建立了相思树高效再生系统,比较了再生系统中瘤状物与正常苗的若干生理生化差异,并用根癌农杆菌介导法进行了PEAS基因、ACS反义基因转化厚荚相思瘤状物的初步研究。其主要研究结果如下: 1.建立了厚荚相思无菌系。通过不同激素浓度浸泡对种子萌发影响的研究发现,浓硫酸结合25mg/L的IAA溶液浸泡8h为较为理想的处理方式,其发芽率可达到48.9%。 2.以茎段、叶片和瘤状物为外植体建立相思树高效率再生系统。其中,最适合茎段增殖的培养基为MS+2.0mg/L KT+0.6 mg/LGA,其增殖率可达到4.125。叶片愈伤组织的诱导率是和2,4-D浓度的增长成正相关,在不添加2,4-D的培养基中,叶片会产生大量的不定根,采用3.0 mg·L~(-1)BA和1.5 mg·L~(-1)2,4-D有利于叶片愈伤组织的诱导,而叶片再生最佳培养基为:MS+3.0 mg·L~(-1)ZT。在瘤状物再生系统优化的过程中,对绿色瘤状物进行切割能提高瘤状物的诱导且芽苗的增殖速度也较快。其中适合瘤状物生长最佳培养基即MS+2.0mg/L BA+3mg/L IAA。在厚荚相思壮苗生根过程中,1/4MS+0.05 mg/LNAA为状苗生根的最佳培养基,生根率可达100%。NAA在生根诱导中没有起者关键的作用,而NAA的添加对壮苗影响程度较大。采用泥炭土移栽的成活率最高达到66.7%。 3.进行厚荚相思瘤状物与正常苗的生理生化指标的测定。试验表明:除了DNA含量接近以外,在瘤状物中CAT酶、过氧化物酶和蛋白质含量都高于普通的正常苗,SDS-PAGE分析也表明瘤状物在分子量为13.8kD多山一个条带。这些差异的出现可能是与瘤状物所处的发育阶段有关。 4.对相思绿色瘤状物进行卡那霉素、潮霉素、羧卞青霉素和头孢霉素抗生素敏感性试验。试验结果表明:400mg/L浓度的卡那霉素明显抑制了瘤状物的生长,可作为有效的抗性筛选浓度。瘤状物对潮霉素较为敏感,10mg/L潮霉素可以作为抗性筛选浓度。而羧卞青霉素和头孢霉素不影响瘤状物的生长。 5.对农杆菌感染相思绿色瘤状物进行初步研究,获得了转入ASC反义基因的GTT,并已分化出小芽。试验结果表明:PEAS基因导入相思瘤状物很难获得抗性瘤状物,瘤状物对菌株EHA105的敏感性不高,直接抗性筛选过程中瘤状物容易褐变死亡,采用延迟筛选的方法将侵染过的瘤状物在MS+2.0mg/LBA+3.0mg/LAA+100mg/L羧卞青霉素培养基上进行恢复生长一个月,再进行抗性筛选也很难获得抗性瘤状物。 在ACS反义基因转化厚荚相思的研究中,0D_(600)1.0-1.5的农杆菌重悬液侵染瘤状物10-20min,共培养培养基pH值为5.8,为本转化系统适合的转化条件。再对转化ACS反义基因的转化体进行抗性筛选研究,采用延迟筛选的方法将侵染过的瘤状物在MS+2.0mg/LBA+3.0mg/LAA+100mg/L头孢霉素培养基上进行恢复生长一个月,再置于MS+2.0mg/LBA+3.0mg/LAA+200-400mg/L卡那霉素+100mg/L头孢霉素培养基上筛选一个月,选择后的瘤状物置于MS+2.0mg/LBA+3.0mg/LAA+400mg/L卡那霉素+100mg/L头孢霉素培养基上继续筛选2个月。最后获得10个转ACS反义基因的抗性瘤状物系,转化的瘤状物已开始分化小芽点,经GUS组织化学检测表明gus基因已整合进瘤状物中。


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