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猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定及gD基因的克隆

曾显成  
【摘要】: 本试验从福州郊区某猪场发生疑似伪狂犬病的仔猪中分离到一株病毒,进行生物学特性分析,并对囊膜蛋白gD基因进行克隆和序列分析。该毒株初次接种Vero细胞,第1、2代细胞病变不明显,盲传第3代时,24h后细胞开始变圆、集聚成簇、折光度加强,继而萎缩、脱落、出现空洞,可见合胞体。从第4代开始,16h开始出现典型的细胞病变。连续传15代,均产生典型的细胞病变。把适应Vero细胞的病毒液接种MDCK细胞,可得到与Vero细胞相同的细胞病变,连续传20代,均可产生稳定的细胞病变。试验证实该病毒具有泛嗜性和融细胞性,符合疱疹病毒有关特征。运用琼脂糖固体培养基进行蚀斑克隆纯化病毒,得到了性状稳定的病毒克隆株,并对克隆株增殖培养作为本试验的种毒进一步试验。 该病毒感染MDCK细胞制作细胞组织超簿切片,电镜观察可见直径约110-180nm大小不等、不规则圆形、有囊膜的伪狂犬病毒粒子。该病毒在MDCK细胞上TCID_(50)为10~(6.601)/0.1ml。用固定病毒稀释血清法进行中和试验,能被猪伪狂犬标准阳性血清所中和,其中和效价为1∶77。制作细胞飞片,8h后经伪狂犬标准荧光抗体染色,在荧光显微镜下可观察到细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光。对乙醚、热、胰蛋白酶敏感,在pH5.0-9.0之间保持稳定,不凝聚鸡、大鼠红细胞。感染仔猪症状较轻,但在攻毒后25天,可检测到伪狂犬的抗体,并在仔猪的肺气管冲洗液中回收到同样理化特性的病毒,说明仔猪隐性感染或隐性带毒的存在。接种成兔和小白鼠均可出现典型的伪狂犬病症状,具有嗜神经性。接种大鼠和鸡均不敏感。鸡胚尿囊膜方法接种9-12日龄鸡胚,86h可见鸡胚尿囊膜水肿、出血,有大小不一白色痘斑样病灶,胚体萎缩,头盖部突起、全身弥漫性出血。试验证实,本研究所分离的病毒为猪伪狂犬病毒,并命名为PRV FZ株。 根据GenBanK已发表的PRV gD基因序列(AJ271966),设计合成一对特异性引物,采用病毒感染MDCK细胞培养物方法提取病毒基因组DNA作为模板,通过PCR技术扩增gD基因,成功地扩增出1579bp的特异性条带,其开放阅读框长1203bp,共编码400氨基酸。在gD基因的上、下游引入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点,将回收的gD基因片段克隆到载体PCAGGS,构建质粒PCA-gD,并转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞,进行抗性筛选,得转化子经PCR鉴定和双酶切分析筛选出阳性克隆。经琼脂糖电泳试验,成功的克隆到gD基因。通过对gD基因测序结果的分析,PRV FZ株gD基因与Min A株、Fa株、La株、Kaplan株、Ea株碱基序列的同源性分别是99.8%、99.6%、99.4、99.2%、99.1%,氨基酸序列的同源性分析分别是99.5%、99.0%、99.3%、97.8%和98.5%。表明不同PRV gD基因高度保守,这与整个疱疹病毒保守性是一致的。


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