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水稻衰老相关基因cDNA片段的克隆与转化

张洪平  
【摘要】: 为了揭示作物叶片衰老的分子机制,发展和完善作物衰老理论,本实验以水稻两优培九为实验材料展开研究。首先,从水稻衰老叶片中提取总RNA,根据GenBank中拟南芥等多种植物的SAG_(12)cDNA的保守序列,设计合成特异性引物,RT-PCR扩增出SAG_(12)基因片段并克隆到pGEM-T easy载体,测序确定其正确性,获得SAG_(12)部分cDNA序列。其次,SAG_(12)克隆片段经Sall和EcoRI酶切消化反向插入到植物载体pCAMBIA1300构成pCAMBIA 1300-anti-SAG_(12),中间载体;再根据GenBank中拟南芥SAG_(12)启动子的序列,设计合成特异性引物,以PS-T(Promoter of SAG_(12) in pGEM-T Easy Vector)为模板,进行PCR扩增,PCR产物经纯化、双酶切消化插入到植物表达中间载体pCAMBIA1300-anti-SAG_(12),构建植物衰老特异性反义表达载体(P_(SAG12)-anti-SAG_(12))。最后,提取该质粒转化农杆菌,以S2F与S2R为引物进行PCR鉴定,证明P_(SAG12)-anti-SAG_(12)质粒已转化进农杆菌,用携带P_(SAG12)-anti-SAG_(12)质粒的农杆菌侵染水稻两优培九胚性愈伤组织,经潮霉素筛选得27株抗性植株。


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