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防治烟草赤星病根际芽孢杆菌的筛选及其抗菌物质研究

方敦煌  
【摘要】: 从健康烟草根际分离到669株根际芽孢杆菌,通过平板对峙培养、代谢产物活性检测,获得9株抑制烟草赤星病菌(Alternaria alternata)活性较强的菌株,其菌体及代谢粗提物产生的抑菌圈均在10 mm以上;离体防效和田间小区防治试验表明,B6、B75菌株的含菌发酵液和代谢粗提物的离体防效分别为75.6%、76.9%和62.5%、64.7%,小区防效分别为70.3%、75.8%和60.3%、64.4%。代谢粗提物的抑菌作用试验发现,B75菌株的代谢粗提物在一定浓度范围能抑制赤星病菌孢子萌发、菌丝生长与产孢。 采用生理生化、Biolog和16S rDNA序列测定,对筛选的一株烟草赤星病菌拮抗细菌B75菌株进行了鉴定,生理生化鉴定显示该菌株与Bacillus subtilis极为相似;Biolog鉴定显示其为B.subtilis;进一步对该菌株作16S rDNA序列测定与分析,表明其与己报道的B.subtilis具有99.8%的同源性,二者在所构建的系统发育树上处于同一个分支。因此确定B75菌株属于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。 以NB培养液对B75菌株进行培养试验,结果表明,B75在对数生长的中期开始产生抗菌物质,在生长的衰退期前存在一个产生抗菌物质的高峰期;在25~50℃、pH4.0~8.5范围内均可产生抗菌物质,其中30℃和pH6.0的培养条件下最适。不同的装液量试验结果表明,B75菌株在装液量为100ml/500ml三角瓶时是菌体生长及产生抗菌物质的最适宜量。不同的碳/氮源试验结果表明,甘露醇、酵母膏最有利于B75菌株菌体生长,且产生的抗菌物质抑菌活性较强。 枯草芽孢杆菌B75菌株发酵粗提液的抗菌物质可被饱和度为40%的硫酸铵完全沉淀。对该沉淀的部分理化性质研究发现,121℃处理30min,活性保持不变;在pH 4-8的范围内,随pH的增大,溶解度增大,但pH 8室温下存放24h,活性明显下降;用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K处理,活性无明显降低。该沉淀用磷酸缓冲液溶解后,经Sephadex G25脱盐、Source 15 FLPC(fast protein liquidchromatography)、反相C18 HPLC (high performance liquid chromatography)多次分离、纯化,得到1个活性峰。取活性峰在Q-TOF2(electrospray ionization quadrupoletime-of-flight mass spectrometry)检测时发现有2个峰,分子量为分别为1463.81D、1477.82D。经Q-TOF2和ApexQ FF-MS(Fourier-transform ion cyclotron resonancemass spectrometry)分析,鉴定为芬枯草杆菌素(Fengycin)。 采用浓盐酸、硫酸铵沉淀枯草芽孢杆菌B75的无菌发酵液中的抗菌物质,磷酸缓冲液(50 mmol/L,pH 6.8)、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯8种溶剂提取菌体抗菌物质,并进行生物活性检测和HPLC分析。结果表明硫酸铵沉淀物的活性比浓盐酸强;甲醇、乙醇、乙腈、丙酮提取物具有抑菌活性,其抗菌活性显著低于浓盐酸、硫酸铵沉淀物;同一RP-HPLC条件下,硫酸铵沉淀的杂质比浓盐酸多,浓盐酸与硫酸铵沉淀物的活性峰无差异,甲醇、乙醇、乙腈、丙酮提取物的活性峰可完全重叠,比较发现浓盐酸与硫酸铵沉淀物的活性峰明显不同于菌体提取物。这些结果说明,枯草芽孢杆菌B75液体发酵的无菌滤液、菌体中均存在抗菌物质,且存在两者之中的抗菌物质明显不同:无菌滤液抗菌物质可溶于磷酸缓冲液,而菌体中的则不溶;两者在同一RP-HPLC条件下,出峰时间差异明显。


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