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邻羟基苯甲酸胁迫对不同杉木无性系化感效应及差异蛋白质组分析

杨梅  
【摘要】: 植物化感作用是指植物通过向环境释放特定的次生物质从而对邻近其它植物生长发育产生的有益或有害影响。自毒作用是化感作用的一种特殊表现形式,它广泛存在于自然界的许多物种中。自毒作用,就是植物的叶、根等器官通过分泌、淋溶、腐解等方式向环境中释放自毒物质,当自毒物质在土壤中积累到一定程度后会导致逆境胁迫,引起植株生理代谢调节能力下降,对同种植物种子萌发和生长起抑制作用的现象。 杉木连栽引起的自毒作用已被国内学者所证实,自毒物质的积累可导致杉木林地力衰退、生产力下降。邻羟基苯甲酸是杉木酚酸类自毒物质之一。本研究通过向MS培养基添加此种酚酸进行胁迫实验,并以筛选出的忍耐型和敏感型2种杉木无性系组培苗为试验材料,研究邻羟基苯甲酸胁迫对2个不同抗性杉木无性系叶片的渗透调节因子、抗氧化酶系统、核酸与蛋白质、内源激素若干生理过程的化感效应,并对邻羟基苯甲酸胁迫下2个无性系叶片的差异蛋白质组进行分析。主要研究结果概括如下: 1.邻羟基苯甲酸胁迫对不同杉木无性系叶片渗透调节因子的化感效应 低浓度邻羟基苯甲酸胁迫在胁迫前期膜脂过氧化表现为抑制效应,随着胁迫时间的延长和胁迫浓度的增大,邻羟基苯甲酸对膜脂过氧化的促进效应增强,01号表现出的促进效应比02号弱,MDA的积累速度也相对较慢。质膜透性的化感效应在胁迫前期多表现为促进效应,但01号在40mg/L胁迫浓度下表现为抑制效应,随着胁迫时间延长,2个无性系的促进效应下降,但到胁迫后期,促进效应大幅度提高,02号杉木无性系质膜透性在各浓度胁迫下的促进效应均比01号高,细胞膜结构损害严重。01号杉木无性系的可溶性糖含量表现的促进效应比02号来得更早,效应指数也大于02号,而且在高浓度胁迫下表现出的抑制效应却比02号小。整个胁迫过程中杉木叶片总游离氨基酸含量均表现为促进效应,总体上01号的促进效应大于02号,胁迫后期在40mg/L、80mg/L、120mg/L胁迫浓度下其促进效应指数已分别达到02号的4、8、3倍。脯氨酸的积累对邻羟基苯甲酸胁迫的响应不敏感。 2.邻羟基苯甲酸胁迫对不同杉木无性系叶片抗氧化酶活性的化感效应 各胁迫浓度对SOD活性的化感效应在胁迫初期、中期表现为促进效应,胁迫后期转变为抑制效应:2个无性系SOD活性化感效应的差异主要从胁迫中期开始,02号SOD活性促进效应大幅度下降,并在高浓度胁迫下化感效应为0,而01号依然保持促进效应;胁迫后期出现抑制效应时,01号的抑制效应又低于02号。 2个无性系叶片POD活性的化感效应在均表现为促进效应,胁迫第10天、20天时,各胁迫浓度对01号POD活性的促进效应明显大于02号,而在第30天时则是02号的促进效应更强,表明01号无性系叶片POD参与清除H_2O_2的时期更早。 胁迫初期,2个无性系叶片CAT活性均表现出促进效应,对01号的促进作用大于02号。到了胁迫后期,对01号CAT活性仍然保持促进作用,但胁迫浓度越大,促进作用越小,而对02号则产生了抑制作用,胁迫浓度越大,抑制作用越大。 AsA-POD化感效应均表现为促进效应。胁迫初期,01号无性系迅速启动了AsA-POD清除H_2O_2的功能,在各胁迫浓度下表现出的促进作用均大于02号,虽然02号在胁迫中期时的促进效应强于01号,但差异不大,而到了胁迫后期,01号AsA-POD活性的促进效应有所回升,而02号则发生大幅度下降。 01号的PPO活性在胁迫下均表现为促进效应,而02号则随胁迫延长表现为抑制—促进—抑制的变化特点,表明01号启动了PPO抗氧化的功能,积极参与了植物抵御不良环境的过程,而02号PPO参与氧化物清除的时期晚于01号,并且只是暂时性的。 3.邻羟基苯甲酸胁迫对不同杉木无性系叶片蛋白质及核酸含量的化感效应 邻羟基苯甲酸胁迫对01号DNA合成多表现为抑制效应,而02号多表现为促进效应,01号RNA合成多表现为促进效应,而对02号多表现为抑制效应,可见邻羟基苯甲酸胁迫对不同无性系核酸的作用机制不同,对01号无性系核酸的化感作用主要体现在RNA的合成与分解机制,而对02号则主要影响DNA的合成与分解机制。 在胁迫初期各胁迫浓度对02号蛋白质含量的促进效应大于01号,但在胁迫中后期,02号的促进效应呈下降趋势,01号的促进效应随胁迫浓度加大而不断增大,蛋白质合成能力不断提高,并超过02号。随着胁迫强度增大,01号可能有更多的蛋白质参与了对此种胁迫的响应,从而提高了抗逆性。 4.邻羟基苯甲酸胁迫对不同杉木无性系叶片内源激素含量的化感效应 从总体上看,邻羟基苯甲酸胁迫下对ABA含量表现为促进效应,01号的促进效应大于02号;IAA、GA_3、ZR含量表现为抑制效应,对01号GA3、ZR含量的抑制效应比02号强,但2个无性系间IAA含量的抑制效应差异不显著,在胁迫第30天时,ZR含量在中低胁迫浓度下已开始出现促进效应,而GA_3含量仍为抑制效应,因此推断,杉木叶片内的ZR可能比GA_3更早地修复胁迫对其代谢平衡的伤害作用。 5.杉木叶片蛋白质组的双向电泳技术优化 杉木叶片蛋白质主要分布在pH4-7范围;裂解液中含有硫脲(2mmol/L)才能较充分地溶解蛋白,DTT浓度60 mmol/L、上样量1.5mg时得到的图谱分辨率较好且蛋白斑点分布均匀、清晰,拖尾现象明显减少,平衡液Ⅱ中碘代乙酰胺450 mg·15ml~(-1)时能提高图谱分辨率;采用与质谱兼容的考马斯亮兰进行染色,得到近700个蛋白点。杉木叶片蛋白质双向电泳技术的建立为开展逆境胁迫下杉木的差异蛋白质组学研究奠定了基础。 6.邻羟基苯甲酸胁迫下不同杉木无性系叶片差异表达蛋白的双向电泳图谱分析 运用Image Master 2D Platinum 6.0软件对2个杉木无性系叶片总蛋白质双向电泳进行图谱分析。胁迫第1天时,01号检测到12个差异蛋白,其中上调表达蛋白6个,下调表达蛋白4个,胁迫后新增蛋白点2个;02号检测到2个差异蛋白,其中下调表达蛋白1个,胁迫后消失的蛋白1个。胁迫第3天时,01号检测到7个差异蛋白,其中上调表达蛋白1个,下调表达蛋白5个,胁迫后消失的蛋白1个;02号检测到2个差异蛋白,下调表达蛋白1个,胁迫后新增的蛋白1个。胁迫第5天时,01号检测到12个差异蛋白,上调表达蛋白4个,下调表达蛋白3个,胁迫后消失的蛋白1个,胁迫后新增蛋白4个:02号只检测到胁迫后新增蛋白1个。 可见在邻羟基苯甲酸胁迫下各无性系在不同时期差异表达的蛋白数量不同,01号杉木无性系基因调控体系活跃,对逆境胁迫信号响应灵敏,当外界伤害产生时能较快地调动多个基因表达或关闭,使蛋白表达模式发生变化,有利于机体维持正常的生理活动,以适应或抵抗外界的伤害。 7.邻羟基苯甲酸胁迫下不同抗性杉木无性系叶片差异表达蛋白的质谱鉴定及其生物学功能 利用MALDI—TOF—TOF/MS串联质谱和MASCOT软件对差异表达蛋白进行鉴定和数据搜索,鉴定成功率为48%,鉴定成功的8种蛋白质全部为01号无性系,02号无性系差异表达的蛋白均未得成功鉴定。鉴定成功的蛋白质为: (1)放氧蛋白复合体33KD外周蛋白:与PSⅡ系统水的裂解和氧的释放过程有关。 (2)热激蛋白:包括葡萄糖调节蛋白Grp78和热激蛋白Hsp cognate70、Hsp90,属于分子伴侣,参与蛋白质折叠、变性蛋白的复性与及降解、蛋白质的跨膜运输、遗传物质的复制转录与信号转导等多个过程。 (3)肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIase):参与了异常蛋白的降解及蛋白质折叠的起始过程,对蛋白质形成具有生物功能活性的空间结构非常必要。 (4)26S蛋白酶复合体(26S proteasome):与泛素结合以降解错误折叠或已被损坏的蛋白质,阻止无功能的、具有潜在毒性的蛋白质的集聚,从而介导生物的抗逆性,这对于细胞抵抗逆境具有特殊的防御作用。 (5)质子移位膜ATP酶(F1 ATPase):参与膜外质子入胞或是逆向转运质子于胞外,是细胞耐酸能力的重要调节机制。 (6)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH):是植物光合和呼吸过程必不可少的的核心酶之一,在能量产生中发挥着重要作用,同时具有转录启动子、微管排列及诱导细胞凋亡等功能。 (7)微管蛋白(Tublin):微管蛋白与细胞形态、细胞内的物质运输、信号转导、细胞分裂繁殖等生命活动密切相关,对环境条件的反应很敏感。 (8)脯氨酰tRNA合成酶(ProRS):促使Pro氨酰化,提高tRNA利用率,以有利于蛋白质的合成,也可能影响氧化酶的转录与翻译,阻止由于这些酶累积而导致的损伤。


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