黄曲条跳甲关键功能基因的克隆及利用RNAi技术控制害虫

【摘要】： 黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)(鞘翅目Coleoptera:叶甲科Chrysomelidae)是广泛分布于世界各地的重要害虫。本论文从黄曲条跳甲能量代谢系统和嗅觉识别系统两个生命活动的主要方面出发,采用RACE技术分别克隆了跳甲的精氨酸激酶基因和一个特殊的气味受体基因,应用生物信息学方法对基因及表达蛋白序列进行了分析;并基于目的基因的功能区域,设计和构建了双链RNA(dsRNA)片段;采用RNA干扰技术,从生物体自身功能角度出发,破坏其正常能量代谢途径或使之丧失气味识别能力,从而达到有效防治害虫的目的。我们也证明基于精氨酸激酶及该气味受体的RNA干扰技术是一项潜在和有吸引力的新技术,将有助于发展新的害虫控制试剂。主要内容如下: 1.利用RACE技术克隆获得黄曲条跳甲精氨酸激酶基因(Phyllotreta striolataArginine kinase,PsAK),cDNA全长为1 508 bp,PsAK的全长cDNA已在GenBank登录,登录号为EU420057。PsAK的5′、3′端非编码区分别为51 bp和386 bp,开放阅读框(ORF)为1 071 bp,ORF编码356个氨基酸,其蛋白分子量为40.02KDa,预测的等电点为5.86。利用蛋白质功能位点分析软件对PsAK氨基酸序列进行分析结果显示:位于PsAK氨基酸序列中的7个氨基酸CPTNLGT(271-277)是精氨酸激酶的活性中心部位序列,其中第271位的半胱氨酸(Cys)是精氨酸激酶所必需的酶活性位点。PsAK与已报道的其他昆虫的精氨酸激酶氨基酸序列比对,相似性达66%-91%。PsAK模拟的3-D结构非常类似Limulus polyphemusAK(LpAK)的过渡状态复合体的晶体结构,其序列一致性达到75%,在重叠的356个残基中,RMSD的偏差仅为0.7 A。高度保守的残基Asp62的OD_2原子与Arg193的NH_2的空间距离仅2.86 A,可以形成强烈的静电相互作用,起到了稳定分子空间构象作用。通过与LpAK空间结构进行SuperPose叠合可预测出,在活性部位上有五个带正电荷簇(Arg124,Arg126,Arg229,Arg280,Arg309)催化时与底物ADP结合;有七个保守的氨基酸(Gly64、Val65、Tyr68、Cys271、Ser63、Glu225、Glu314)与底物精氨酸协同结合。采用邻接法(neighbour joining,NJ)聚类分析结果表明,PsAK与其近缘种赤拟谷盗Tribolium castaneum的亲缘关系最近,都属于分类中经典的第一组类型。 2.选择PsAK的332 bp核苷酸片段(碱基790到1122,包含精氨酸激酶活性位点motif CPTNLGT)构建dsRNA,然后配置含有不同浓度dsRNA的测试液喷洒于跳甲取食幼苗的子叶或叶片上。结果表明跳甲成虫在7天左右表现出RNAi效应,并开始出现死亡现象;两周左右,dsRNA表现出明显的抑制效应,跳甲成虫死亡现象十分明显。我们确定了其LC50的值为0.80 ng/mL。我们也分析了dsRNA喷洒对跳甲生活周期的影响。结果表明,四周后在不加dsRNA的对照组中,有超过90%的成虫存活,每个雌虫平均产卵49个,74%的卵可孵化成幼虫;而在喷洒不同浓度的dsRNA实验组中,成虫的存活率为15%-85%,均显著的低于对照组;实验组中雌虫的平均产卵数为7-41个,仅为对照组(49个卵/雌)的14%-84%;当实验组的dsRNA浓度为1.60 ng/mL时,仅有不到13%的卵能孵化成幼虫。dsRNA喂饲分析表明,利用微量的dsRNA干扰害虫的精氨酸激酶能够有效地损害其生存和繁殖。RT-PCR分析表明,与对照组相比,摄食dsRNA的测试组成虫中肠AK基因转录活性降低,AK基因mRNA积累显著减少。与未处理的对照组相比,AK的酶活检测显示出明显的酶活性降低(P＜0.05),RT-PCR与酶活性检测提供了链接AK基因沉默和甲虫滞育死亡的分子证据。本研究首次选用精氨酸激酶这个特殊基因,从生物体自身功能角度出发破坏其能量代谢途径,从而导致害虫死亡及生育力显著下降。这些都表明基于精氨酸激酶的RNA干扰技术将有助于发展新的害虫控制试剂,在害虫防治中发挥作用。 3.从黄曲条跳甲触角中克隆得到特殊的气味受体基因——果蝇气味受体Or83b同源基因,命名为PsOr1,其基因编码区为1 437 bp,编码478个氨基酸残基。其蛋白理论分子量为54.06 KDa,预测的等电点为7.98。利用生物信息学软件预测PsOr1具有典型的G-蛋白偶联受体特征,有七个转膜螺旋,第Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ螺旋轴和第Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ螺旋轴反向平行,除转膜螺旋Ⅳ的长度为18个氨基酸外,其它六个转膜螺旋的长度均为23个氨基酸。但是其N_(in)-C_(out)的膜拓扑学与经典的GPCR蛋白相反。PsOr1与已经报道的昆虫同类嗅觉受体有较高的同源性,组成蛋白羧基端的164个氨基酸(包括3个转膜螺旋Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ)与其他昆虫同类嗅觉受体的同源性为82%-95%;特别是与近缘种赤拟谷盗Tribolium.castaneum同源性高达95%,相似性达97%。这表明该区域极端保守的残基是由于进化中的负选择压力而保留下来,对蛋白的结构与功能至关重要。半定量RT-PCR研究表明,PsOr1主要在跳甲成虫触角中表达,在头部(包含口器)也有表达,但表达量相对较低,在成虫其他的部位不表达,表明PsOr1可能也参与化学刺激的识别过程。 4.PsOr1基因具有高度的同源性,预示这个基因在昆虫嗅觉中的重要作用。为了验证PsOr1基因与Drosophila melanogaster Or83b(DmOr83b)同源基因具有相类似功能,我们用RNA干扰技术沉默PsOr1来检测跳甲对不同气味的反应能力。PsOr1 cDNA转膜螺旋第Ⅴ到Ⅶ之间的核苷酸片段被用于构建dsRNA。化学趋向行为反应表明,基于与虚拟假设(Null hypothesis,即偏向气味源方向和偏离气味源方向停留时间相等)比较的基础上,野生型对引诱剂allyl isothiocyanate的气味反应敏感(t_(14)=2.99,p=0.010);对拒避剂a-pinene表现出明显的拒避行为(t_(13)=3.04,p=0.009)。PsOr1嗅觉受体被沉默的跳甲与野生型相比,对引诱剂allyl isothiocyanate(t_(19)=0.925,p=0.367)和拒避剂a-pinene(t_(19)=0.535,p=0.599)却没有明显定向行为反应,表现为随机分布行为。RT-PCR分析从分子水平证明了RNAi处理后的跳甲触角嗅觉受体表达受到了明显抑制。本研究进一步从产卵选择性和取食选择性两方面研究dsRNA沉默PsOr1后,跳甲对芥菜、萝卜、大白菜、山西白和芥蓝等5种十字花科蔬菜的寄主选择性。结果表明,在野生型对照组中,跳甲的产卵选择性与取食选择性基本一致,芥菜为其最嗜寄主,芥蓝为最不嗜寄主,两者差异显著(P＜0.05)。利用跳甲在供试植株上的落虫量和取食面积来分析其取食选择性时,所得结果一致,且两者呈显著性正相关(r=0.9472,P＜0.05);而在RNAi处理后的实验组中,跳甲产卵选择性和取食选择性在5种十字花科蔬菜中与对照组相比有显著差异,表明RNAi沉默嗅觉受体显著损害了黄曲条跳甲对寄主植物的选择性。本研究也表明通过切断害虫嗅觉对寄主植物的识别途径可提供新的害虫控制策略。